產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Hieff NGS^® Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit for MGI^®是用于MGI^®測(cè)序平臺(tái)的RNA測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建試劑盒，包含RNA----片段化試劑，反轉(zhuǎn)錄試劑，常規(guī)和鏈特異性dscDNA合成試劑，以及文庫(kù)擴(kuò)增試劑。可以銜接mRNA純化試劑盒或rRNA去除試劑盒構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。二鏈合成模塊配有兩種Buffer，客戶可根據(jù)需要進(jìn)行常規(guī)建庫(kù)或鏈特異性建庫(kù)。其中鏈特異性二鏈合成Buffer中將dTTP替換為dUTP，使cDNA第二鏈中摻入dUTP，而本試劑盒使用的高保真DNA聚合酶無法擴(kuò)增含尿嘧啶的DNA模板，實(shí)現(xiàn)鏈特異性。提供的所有試劑都經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制和功能驗(yàn)證，保證了文庫(kù)構(gòu)建的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存方法

干冰運(yùn)輸。-20℃保存。有效期1年。

注意事項(xiàng)

一、關(guān)于操作

1. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2. 請(qǐng)于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進(jìn)行各步驟反應(yīng)，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近。

4. 請(qǐng)使用無RNase污染的耗材，并對(duì)實(shí)驗(yàn)區(qū)域定期進(jìn)行清理，推薦使用ThermoFisher公司的RNAZap^TM高效核酸去除噴霧去除RNA酶污染。

5. PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。推薦將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測(cè)區(qū)進(jìn)行強(qiáng)制性的物理隔離；配備文庫(kù)構(gòu)建專用移液器等設(shè)備；定時(shí)對(duì)各實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行清潔（推薦使用ThermoFisher公司的DNAZap^TM高效核酸去除噴霧），以保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈度。

二、關(guān)于接頭連接（Adapter Ligation）

1. 目前華大智造有2種序號(hào)的接頭：1-128和501-596。關(guān)于其使用要求，請(qǐng)?jiān)斠娙A大智造“關(guān)于Adapter使用"有關(guān)說明或咨詢本公司。此外，華大智造申明：2種接頭由于設(shè)計(jì)工藝不同，禁止混用，否則測(cè)序數(shù)據(jù)無法拆分！

2. 我們建議選用高質(zhì)量的商業(yè)化接頭，如客戶使用自制接頭，請(qǐng)委托具有NGS引物合成經(jīng)驗(yàn)的公司，并備注需進(jìn)行嚴(yán)格的防污染控制。此外，進(jìn)行接頭退火操作時(shí)，請(qǐng)?jiān)诔瑑襞_(tái)完成。每次只操作一種接頭，防止交叉污染。

3. 建庫(kù)過程中，接頭濃度過高或過低都會(huì)導(dǎo)致建庫(kù)成功率變低。本試劑盒操作方案中，所加入的接頭體積固定為5 μL，請(qǐng)根據(jù)初始的RNA投入量，參考表1對(duì)接頭進(jìn)行稀釋。接頭稀釋液請(qǐng)選擇0.1×TE buffer，稀釋過的接頭可在4°C保存48小時(shí)。

表1 Input Total RNA量與接頭使用濃度推薦表

*可根據(jù)不同類型total RNA樣本及投入量，按需求適當(dāng)調(diào)整Adapter使用量

三、關(guān)于文庫(kù)擴(kuò)增（Library Amplification ）

1. 本試劑盒中的文庫(kù)擴(kuò)增組分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所組成，在第一代的基礎(chǔ)上，大大增強(qiáng)了擴(kuò)增的均一性，即使是低拷貝的基因，也能進(jìn)行無偏好性地?cái)U(kuò)增。

2. 文庫(kù)擴(kuò)增步驟需要嚴(yán)格控制擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。循環(huán)數(shù)不足，將導(dǎo)致文庫(kù)產(chǎn)量低；循環(huán)數(shù)過多，又將導(dǎo)致文庫(kù)偏好性增加、重復(fù)度增加、嵌合產(chǎn)物增加、擴(kuò)增突變積累等多種不良后果。表2列舉了使用本試劑盒進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增，Input Total RNA量與相應(yīng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的推薦。

表 2 Input Total RNA 量與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)推薦表*

【注】：*由于文庫(kù)產(chǎn)量不僅與投入量和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)相關(guān)，樣本質(zhì)量、片段化條件、分選條件等都會(huì)影響產(chǎn)量。建庫(kù)過程中請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況綜合考慮，選擇最合適的建庫(kù)條件。

四、DNA磁珠純化與分選（Bead-based Clean Up and Size Selection）

1. 建庫(kù)過程中有多個(gè)步驟需要使用DNA純化磁珠，我們推薦使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure^® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)進(jìn)行DNA純化和分選。

2. 磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫，否則會(huì)導(dǎo)致得率下降、分選效果不佳。

3. 磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

4. 轉(zhuǎn)移上清時(shí)，請(qǐng)勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫(kù)質(zhì)量。

5. 磁珠洗滌使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

6. 產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)反應(yīng)；過分干燥又會(huì)導(dǎo)致磁珠開裂進(jìn)而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

7. DNA純化或長(zhǎng)度分選產(chǎn)物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脫，產(chǎn)物于4°C可保存2天，-20°C可保存1個(gè)月。

五、關(guān)于文庫(kù)質(zhì)檢（Library Quality Analysis）

1. 通常情況下，構(gòu)建好的文庫(kù)可通過長(zhǎng)度分布檢測(cè)和濃度檢測(cè)來進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

2. 文庫(kù)濃度檢測(cè)可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR絕對(duì)定量的方法。

3. 推薦使用qPCR方法進(jìn)行文庫(kù)濃度檢測(cè)：Qubit^®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測(cè)定方法時(shí)，無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物及其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)物；qPCR絕對(duì)定量基于PCR擴(kuò)增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫(kù)（即可測(cè)序的文庫(kù)），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測(cè)序文庫(kù)的干擾。

4. 文庫(kù)濃度檢測(cè)不可使用：基于光譜檢測(cè)的方法，如NanoDrop^®等。

5. 文庫(kù)長(zhǎng)度分布檢測(cè)，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細(xì)管電泳或微控流原理的設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。

六、自備材料（Other Material）

1. mRNA富集試劑盒：Hieff NGS^® mRNA Isolation Master Kit（Yeasen Cat#12603）。

2. rRNA去除試劑盒：Hieff NGS^® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (Yeasen Cat#12253)。

3. RNA純化磁珠： Hieff NGS^® RNA Cleaner（Yeasen Cat#12602）或其他等效產(chǎn)品。

4. DNA純化磁珠：Hieff NGS^® DNA Selection Beads（Yeasen Cat#12601）或AMPure^® XP Beads（A63880）或其他等效產(chǎn)品。

5. RNA質(zhì)控：Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效產(chǎn)品。

6. Adapters：華大智造或本公司。

7. 文庫(kù)質(zhì)檢：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效產(chǎn)品；文庫(kù)定量試劑。

8. 其他材料：無水乙醇、無菌超純水、低吸附槍頭、PCR管、磁力架、PCR儀等。

建庫(kù)流程圖

圖1 RNA建庫(kù)操作流程

使用方法

Part 1：目標(biāo)RNA的富集和片段化

該步驟是建庫(kù)前的目標(biāo)RNA制備，根據(jù)建庫(kù)需求可選擇Poly(A) mRNA Isolation方案（方案A）或rRNA Depletion方案（方案B）。Yeasen Cat#13333建庫(kù)模塊不包含該步驟所用試劑，請(qǐng)客戶根據(jù)建庫(kù)需要自備相應(yīng)的試劑。

方案A：mRNA純化和片段化（mRNA Purification and Fragmentation）

樣本要求

該方案使用Hieff NGS^® mRNA Isolation Master Kit（Yeasen Cat#12603）進(jìn)行mRNA富集。適用于起始模板量為10 ng-4 μg（體積≤50 μL）的高質(zhì)量動(dòng)物、植物和真菌等真核生物的總RNA。如初始RNA濃度偏低，體積超過50 μL，可使用Hieff NGS^® RNA Cleaner（Yeasen Cat#12602）磁珠進(jìn)行濃縮。RNA需通過Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片檢測(cè)，RIN值要求＞7，以保證mRNA有完整的poly(A)尾結(jié)構(gòu)。本試劑盒的mRNA分離模塊使用的是oligo (dT)磁珠，只有帶poly(A)尾的mRNA才能被提取；其他不具poly(A)尾的RNA，如非編碼RNA、無poly(A)尾的mRNA等不能適用本試劑盒。此外，FFPE樣本中的mRNA降解嚴(yán)重，通常無完整的poly(A)尾結(jié)構(gòu)，故亦無法使用本試劑盒進(jìn)行建庫(kù)。

操作步驟

1. 將mRNA Capture Beads從2-8℃取出，靜置使其溫度平衡至室溫，約30 min。

2. 準(zhǔn)備一個(gè)Nuclease Free離心管，取10 ng-4 μg總RNA，用Nuclease free水將體積補(bǔ)至50 μL，冰上放置備用。

3. 顛倒或旋渦振蕩混勻磁珠，吸取50 μL磁珠懸液加入至50 μL總RNA樣品中，用移液器吹打6次，使其充分混勻。

4. 將磁珠與RNA的混合物置于PCR儀中，65℃，5 min；25℃，5 min；25℃，hold，完成RNA與捕獲磁珠的結(jié)合。

5. 將樣品置于磁力架中，室溫靜置5 min，使mRNA與總RNA分離，小心移除上清。

6. 將樣品從磁力架上取出，用200 μL Beads Wash Buffer重懸磁珠，移液器反復(fù)吹打6次以*混勻。將樣品置于磁力架中，室溫靜置5 min，小心移除上清。

7. 重復(fù)步驟6，共洗滌兩次。

8. 將樣品從磁力架上取出，加入50 μL Tris Buffer重懸磁珠，用移液器反復(fù)吹打6次以*混勻。

9. 將樣品置于PCR儀中，80℃，2 min；25℃，hold，將mRNA洗脫下來。

10. 將樣品從PCR儀中取出，加入50 μL Beads Binding Buffer，用移液器反復(fù)吹打6次以*混勻。

11. 室溫放置5 min，使mRNA結(jié)合到磁珠上。

12. 將樣品置于磁力架中，室溫靜置5 min，小心移除上清。

13. 將樣品從磁力架上取出，用200 μL Beads Wash Buffer重懸磁珠，移液器反復(fù)吹打6次以*混勻，將樣品重新放回

至磁力架中，室溫靜置5 min，吸掉全部上清。

【注】：最后需要用10 μL移液器吸干凈殘留液體。

14. 將樣品從磁力架上取出，用18.5 μL Frag/Prime Buffer重懸磁珠，用移液器吹打6次以*混勻；將樣品置于PCR儀中（預(yù)設(shè)為94℃），可參考表3選擇片段化程序，但不同物種片段化的效果有差異，客戶可先根據(jù)自己的情況，做個(gè)片段化時(shí)間的梯度，比如94℃，5 min。使用Agilent 2100分析mRNA純化產(chǎn)物大小。

表3 mRNA----片段化程序推薦

14. 片段化程序結(jié)束后，為防止poly(A)尾RNA與磁珠結(jié)合，請(qǐng)立即將樣品置于磁力架中，待溶液澄清后，轉(zhuǎn)移17 μL上清至一個(gè)新的Nuclease Free離心管中，立刻進(jìn)入第一鏈合成反應(yīng)（Part 2-Step 1）。

方案B：rRNA去除與RNA-----片段化（rRNA Depletion and RNA Fragmentation）

樣本要求

該方案使用Hieff NGS^® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (Yeasen Cat#12253)去除Total RNA 中的rRNA。適用于人、小鼠、大鼠來源的 1 ng~1 μg （體積≤ 11 μL）總RNA 樣品；適用于完整或部分降解 RNA（如 FFPE RNA）樣品。

操作步驟

Step 1 探針雜交

1. 將探針和雜交Buffer從-20 °C 取出，解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 準(zhǔn)備RNA樣品：根據(jù)投入量和樣品濃度，計(jì)算RNA取樣體積，用Nuclease Free H₂O稀釋至11 μL。

3. 按照表4于200 μL PCR管中配制rRNA去除反應(yīng)體系。

表 4 探針雜交反應(yīng)體系

4. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應(yīng)液離心至管底。

5. 將上述 PCR 管置于PCR儀（可設(shè)置梯度降溫）中，按照表5所示反應(yīng)程序，進(jìn)行探針雜交反應(yīng)。

表5 探針雜交反應(yīng)程序

Step 2  RNase H消化

1.將RNase H消化試劑從-20 °C取出，解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。按照表 6 所示，配制RNase H消化反應(yīng)體系。

表6 RNase H消化反應(yīng)體系

2. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應(yīng)液離心至管底。

3. 將上述 PCR 管置于PCR儀中，設(shè)置反應(yīng)程序：37°C，30 min； 4°C，hold，進(jìn)行RNase H消化反應(yīng)。

Step 3 DNase I 消化

1. 將DNase I消化試劑從-20 °C 取出，解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。按照表7所示，配制DNase I消化反應(yīng)體系。

表7 DNase I消化反應(yīng)體系

2. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應(yīng)液離心至管底。

3. 將上述 PCR 管置于PCR儀中，設(shè)置反應(yīng)程序：37℃，30min； 4℃，hold，進(jìn)行DNase I消化反應(yīng)。

Step 4 RNA純化

1. 準(zhǔn)備工作：將 Hieff NGS^® RNA Cleaner（Yeasen Cat#12602）磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少 30 min。用Nuclease free H₂O配制 80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取 110 μL Hieff NGS^® RNA Cleaner（2.2×，Beads:DNA=2.2:1）至上一步產(chǎn)物中，移液器充分吹打混勻，室溫孵育 5 min。

4. 將PCR管置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入 200 μL Nuclease free H₂O新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育 30 sec 后，小心移除上清。

6. 重復(fù)步驟 5，總計(jì)漂洗兩次。用 10 μL移液器吸干凈殘留液體。

7. 保持 PCR 管始終置于磁力架中，室溫下開蓋干燥磁珠（5~10 min）。

8. RNA洗脫：將PCR 管從磁力架上取下，加入18.5 μL Frag/Prime buffer，使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置 5 min。

9. 將 PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約3 min），小心移取 17 μL 上清至新的Nuclease free PCR 管中，進(jìn)行RNA----片段化。

10. RNA---片段化條件需根據(jù)樣本質(zhì)量進(jìn)行調(diào)整，高質(zhì)量的RNA樣本，片段化條件可參考mRNA---片段化條件（表3）。表8推薦了FFPE不同質(zhì)量樣本的片段化條件。但不同的樣本片段化效果會(huì)存在一定的差異，客戶可根據(jù)自己的樣本情況，做不同片段化條件對(duì)比，選擇合適的片段化條件。

11. 片段化結(jié)束請(qǐng)立即置于冰上，進(jìn)入一鏈合成反應(yīng)（Part 2-Step 1）。

表8 FFPE RNA---片段化條件推薦

*降解RNA的樣本質(zhì)量使用DV₂₀₀指標(biāo)判斷，詳見附錄三說明

Part 2：RNA文庫(kù)構(gòu)建

Step 1 第一鏈cDNA的合成（1^st Strand Synthesis）

該步驟將已經(jīng)富集/片段化的目標(biāo)RNA合成一鏈cDNA。目標(biāo)RNA的富集可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求和樣本情況選擇Poly(A) mRNA isolation方案或rRNA Depletion方案，詳見Part 1。

1. 將第一鏈合成試劑從-20°C取出，顛倒混勻后瞬離。按表9所示，配制第一鏈cDNA合成的反應(yīng)液。

表9 第一鏈cDNA合成反應(yīng)體系

2. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應(yīng)液離心至管底。

3. 將上述PCR管置于PCR儀中，按照表10所示設(shè)置反應(yīng)程序，進(jìn)行第一鏈cDNA的合成。反應(yīng)結(jié)束后立即進(jìn)行第二鏈cDNA的合成。

表10 第一鏈cDNA合成反應(yīng)程序

Step 2第二鏈cDNA的合成/末端修復(fù)/加A（2^nd Strand Synthesis/dA-Tailing）：

1. 將第二鏈合成試劑從-20 °C取出，解凍后顛倒混勻；按照表11所示，配制第二鏈cDNA合成/末端修復(fù)/加A反應(yīng)液。

表11 第二鏈cDNA合成反應(yīng)體系

【注】：*如構(gòu)建普通mRNA文庫(kù)，請(qǐng)使用含dNTP的Buffer；如構(gòu)建鏈特異性mRNA文庫(kù)，請(qǐng)使用含dUTP的Buffer。

2. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應(yīng)液離心至管底。

3. 將上述PCR管置于PCR儀中，按照表12所示設(shè)置反應(yīng)程序，進(jìn)行第二鏈cDNA的合成。

表12 第二鏈cDNA合成反應(yīng)程序

Step 3 接頭連接（Adapter Ligation）

該步驟可在末端修復(fù)和dA尾添加的產(chǎn)物末端，連接特定的MGI^®接頭。

1. 參考注意事項(xiàng)二中的表1，根據(jù)Input RNA量，稀釋Adapter至合適濃度。

2. 將表13中各試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

3. 于3.3步驟結(jié)束后的PCR管中繼續(xù)配制表13所示反應(yīng)體系。

表13 Adapter Ligation體系

【注】：*Ligation Enhancer使用前請(qǐng)上下顛倒、振蕩，充分混勻并瞬時(shí)離心后使用。

**本公司接頭原始濃度為10 μM, 請(qǐng)根據(jù)注意事項(xiàng)二表1的提示，根據(jù)投入量對(duì)接頭進(jìn)行稀釋，使接頭添加體積固定為5 μL。

4. 使用移液器輕輕吹打混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

5. 將PCR管置于PCR儀中，設(shè)置表14所示反應(yīng)程序，進(jìn)行接頭連接反應(yīng)：

表14 Adapter Ligation反應(yīng)程序

Step4連接產(chǎn)物純化（Post Ligation Clean Up）

本方案適用于片段＜200 bp時(shí)，通過兩次純化去除體系中的接頭殘留；當(dāng)插入片段≥200 bp時(shí)，參照附錄二的分選方案，通過純化、分選獲得目標(biāo)長(zhǎng)度的文庫(kù)。

適用于插入片段<200 bp的文庫(kù)（需進(jìn)行兩輪純化）

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取60 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.6×，Beads:DNA=0.6:1）至Adapter Ligation產(chǎn)物中，渦旋或吹打混勻，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復(fù)步驟5，總計(jì)漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，加入52 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約3 min），小心移取50 μL上清至新PCR管中，再進(jìn)行一輪純化。

9. 吸取40 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.8×，Beads:DNA=0.8:1）至上一步產(chǎn)物中，渦旋或吹打混勻，室溫孵育5 min。

10. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約3 min），小心移除上清。

11. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

12. 重復(fù)步驟11，總計(jì)漂洗兩次。

13. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過5 min）。

14. 將PCR管從磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

Step 5 文庫(kù)擴(kuò)增（Library Amplification）

該步驟將對(duì)純化或長(zhǎng)度分選后的接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集。

1. 將表15中的試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無菌PCR管中配制表15所示反應(yīng)體系。

表15  接頭連接產(chǎn)物PCR反應(yīng)體系

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

4. 將PCR管置于PCR儀中，設(shè)置表16示反應(yīng)程序，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表16  PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序

*文庫(kù)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)需根據(jù)樣本質(zhì)量、投入量等建庫(kù)條件進(jìn)行調(diào)整，詳見注意事項(xiàng)三。

Step 6 擴(kuò)增產(chǎn)物磁珠純化（Post Amplification Clean Up）

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取45 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至Adapter Ligation產(chǎn)物中，渦旋或吹打混勻，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復(fù)步驟5，總計(jì)漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，進(jìn)行文庫(kù)定量、質(zhì)檢。

Step 7 文庫(kù)質(zhì)量控制

通常情況下，構(gòu)建好的文庫(kù)可通過濃度檢測(cè)和長(zhǎng)度分布檢測(cè)來進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，具體請(qǐng)參見注意事項(xiàng)五。

附錄一：mRNA---片段化效果展示

圖2. mRNA不同打斷時(shí)間對(duì)應(yīng)的RNA---片段范圍。分別以94°C，10 min、94°C，7min和94℃，5 min處理。打斷后mRNA進(jìn)行進(jìn)行2.2X 磁珠純化，通過Agilent 2100 Bioanalyzer進(jìn)行檢測(cè)。

【注】：本結(jié)果使用的RNA是Agilent公司的Universal Human Reference RNA，若使用其他來源的RNA，最好優(yōu)化打斷時(shí)間。

附錄二：分選條件說明

分選方案適用于94°C，10 min、94°C，7min和94℃，5 min片段化的RNA建庫(kù)，可以獲得插入片段大于200bp的文庫(kù)：

方案一：接頭連接產(chǎn)物純化后分選

0.6× Hieff NGS^® DNA Selection Beads接頭連接產(chǎn)物的純化

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取60 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.6×，Beads:DNA=0.6:1）至Adapter Ligation產(chǎn)物中，渦旋或吹打混勻，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復(fù)步驟5，總計(jì)漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，加入102 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，準(zhǔn)備進(jìn)行雙輪分選。

【注】：Ligation Enhancer中含有的高濃度PEG會(huì)對(duì)磁珠雙輪分選產(chǎn)生影響，所以必須經(jīng)過一輪純化后再進(jìn)行雙輪分選。

雙輪分選（以94°C，7min打斷，分選文庫(kù)大小為380bp~480bp為例說明，其他文庫(kù)大小按推薦比例進(jìn)行磁珠分選）

1. 請(qǐng)渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證混勻。

2. 根據(jù)DNA---片段長(zhǎng)度要求，參考表17，在上述100 μL DNA中加入第一輪分選磁珠65 μL(0.65×），渦旋或移液器吹打10次混勻。

【注】：此表推薦的雙輪分選比例適用于Hieff NGS^® DNA Selection Beads；表中“×"表示樣品DNA體積。如所需文庫(kù)插入片段主峰為300 bp時(shí)，若在短接頭連接之后分選，樣品DNA體積為100 μL，則第一輪分選磁珠使用體積為0.65×100 μL=65 μL，第二輪分選磁珠使用體積為0.15×100 μL=15 μL。

3. 室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移上清到干凈的離心管中，殘留1-2 μL溶液管底。

5. 參考表17向上清中加入第二輪分選磁珠15 μL(0.15×）。

6. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫靜置5 min。

7. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約3 min），小心移除上清。

8. 保持PCR管始終處于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，小心移除上清。

9. 重復(fù)步驟8。

10. 保持PCR管始終處于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（約3 min）。

11. 將PCR管從磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置5 min。

12. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約3 min），小心轉(zhuǎn)移20 μL上清至干凈管中。

表17 短接頭文庫(kù)分選推薦磁珠比例

圖3. 1ug 293 total RNA，在94°C，10 min、94°C，7min和94℃，5 min片段化后，根據(jù)表17推薦的磁珠比例得到的文庫(kù)大小。

方案二：接頭連接產(chǎn)物直接分選（以94°C，7min打斷，分選文庫(kù)大小為410bp~510bp為例說明，其他文庫(kù)大小按推薦比例進(jìn)行磁珠分選）

500 ng以上的總RNA做mRNA抓取后建庫(kù)，推薦直接分選，體系比較粘稠，需要小心添加，RNA質(zhì)量略差樣本可能會(huì)有接頭殘留。

1. 請(qǐng)渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證混勻。

2. 根據(jù)DNA---片段長(zhǎng)度要求，參考表18，的連接體系中加入第一輪分選磁珠20 μL(0.20×），渦旋或移液器吹打10次混勻。室溫孵育10 min。

【注】：此表推薦的雙輪分選比例適用于Hieff NGS^® DNA Selection Beads；表中“×"表示樣品DNA體積。如所需文庫(kù)插入片段主峰為300 bp時(shí)，若在短接頭連接之后分選，樣品DNA體積為100 μL，則第一輪分選磁珠使用體積為0.20×100 μL=20 μL，第二輪分選磁珠使用體積為0.1×100 μL=10 μL。

3. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移 100 μL上清到干凈的離心管中，。

4. 參考表18向上清中加入第二輪分選磁珠10 μL(0.10×）。

5. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫靜置10 min。

6. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約3 min），小心移除上清。

7. 保持PCR管始終處于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，小心移除上清。

8. 重復(fù)步驟7。

9. 保持PCR管始終處于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（約3 min）。

10. 將PCR管從磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置5 min。

11. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約3 min），小心轉(zhuǎn)移20 μL上清至干凈管中。

表18 短接頭文庫(kù)分選推薦磁珠比例

附錄三：FFPE樣本建庫(kù)說明

1. FFPE RNA質(zhì)量評(píng)價(jià)

rRNA去除建庫(kù)方案可用于FFPE等低質(zhì)量的 Total RNA 樣本，但由于不同FFPE樣本的質(zhì)量差距較大，需要根據(jù)樣本情況調(diào)整建庫(kù)條件。常規(guī)評(píng)價(jià) RNA 樣本質(zhì)量的參數(shù)是 RIN 值，但是對(duì)于 FFPE 這種降解的樣本，并不能*用 RIN 值來準(zhǔn)確衡量樣本的質(zhì)量，此時(shí)還需要用到 DV₂₀₀指標(biāo)。DV₂₀₀ 表示樣本中大于 200nt的 RNA 片段所占的比例，對(duì)于降解嚴(yán)重的 FFPE 樣本，DV₂₀₀值能夠更好的反應(yīng)樣本的質(zhì)量。

DV₂₀₀計(jì)算方法如下：

① 在一個(gè)檢測(cè)完成的 Agilent 2100 Bioanalyzer 結(jié)果圖中，在 Local 下選擇 Advanced

② 勾選 Smear Analysis 下的 Perform Smear Analysis 選項(xiàng)

③ 選擇Region Table頁面，鼠標(biāo)右擊，選擇Add Region

④ 調(diào)整指示線的范圍即可得到所選片段范圍 所占的比例 % of Total

2. FFPE RNA建庫(kù)示例

下表展示了不同質(zhì)量FFPE樣本在不同建庫(kù)條件下的文庫(kù)分布，以供參考。對(duì)于降解嚴(yán)重的FFPE RNA（DV₂₀₀<50%）和起始量低的文庫(kù)構(gòu)建，我們推薦接頭連接后采用兩次純化方案，以減少文庫(kù)損失。