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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 規格 | 100T |
|---|---|---|---|
| 貨號 | 11121ES60 | 應用領域 | 醫療衛生,化工,生物產業 |
產品介紹
產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規格 | 價格（元） |
Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) | 11121ES60 | 100 T | 935.00 |
產品描述
Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)是含有gDNA去除步驟的cDNA第一鏈合成試劑盒。該試劑盒基于Hifair® Ⅱ Reverse Transcriptase而開發。該酶熱穩定性大幅度提高，可耐受高達50℃的反應溫度，適合具有復雜二級結構的RNA模板的逆轉錄。同時，該酶增強了與模板的親和力，適合少量模板以及低拷貝基因的逆轉錄。Hifair® Ⅱ Reverse Transcriptase合成全長cDNA的能力也有了提升，可擴增長達10 kb的cDNA。
該試劑盒包含gDNA digester，可去除RNA模板中殘留的基因組DNA污染，保證后續結果更加可靠。該試劑盒提供兩種cDNA合成引物：Random Primers N6 和oligo (dT)18，用戶可根據需要，選擇Random Primers N6，Oligo (dT)18或Gene Specific Primers作為逆轉錄引物，合成的單鏈cDNA產物可直接用來進行后續PCR或者qPCR反應。
產品組分
編號 | 組分 | 產品編號（規格） 11121ES60 (100 T) |
11121-A | RNase-free ddH2O | 1 mL×2 |
11121-B | 5×gDNA digester Buffer | 200 μL |
11121-C | gDNA digester | 100 μL |
11121-D | 5×Hifair® Ⅱ Buffer plus | 400 μL |
11121-E | Hifair® Ⅱ Enzyme Mix | 200 μL |
11121-F | Oligo (dT)18 (50 μM) | 100 μL |
11121-G | Random Primers N6 (50 μM) | 100 μL |
【注】：1）5×Hifair® Ⅱ Buffer plus包含gDNA digester抑制劑和dNTP；2）Hifair® Ⅱ Enzyme Mix包含RNase inhibitor。
運輸與保存
冰袋運輸。-20℃保存，有效期18個月。
注意事項
1）反應液的配制應在冰上操作完成，操作過程應避免RNase污染。
2）建議RNA是溶于水而不是TE中，因為TE會干擾gDNA去除以及逆轉錄反應。
3）可以不經過基因組去除步驟，直接進行逆轉錄，這樣所得到的結果與使用Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Cat No. 11119ES）效果一致。但是請勿將gDNA digester與11119ES中的5×Hifair® Ⅱ Buffer配套使用，因其不含終止gDNA 去除反應的成分，會影響反轉錄和后續的qPCR實驗。
4）本產品僅作科研用途！
關于逆轉錄引物的選擇
1） 如果模板為真核生物來源，建議選擇Oligo (dT)18 ，與真核生物mRNA的3’ Poly A尾配對，可獲得最高產量的全長cDNA。
2）原核生物RNA的反轉錄請選用Random Primers N6或者基因特異性引物。
3）Random Primers N6適用性較廣，適用于mRNA、rRNA、tRNA、small RNA和LncRNA等模板。
4）使用Random primers N6，進行2 kb以下的cDNA合成時，Random primers N6的使用量為 1-2 μL；2 kb 以上的cDNA合成時，Random primers N6 的使用量為0.4-1 μL。
第一鏈cDNA合成操作步驟
一、若實驗需要去除殘留基因組DNA
1. 在RNase-free離心管中配制如下混合液，用移液器輕輕吹打混勻。42℃孵育2 min。
組分 | 使用量 |
RNase-free ddH2O | To 10 μL |
5× gDNA digester Buffer | 2 μL |
gDNA digester | 1 μL |
Total RNA | 1 ng -5 μg* |
or mRNA | 1 ng-500 ng* |
【注】：* 若后續實驗為qPCR，Total RNA投入量為1 ng -1 μg；mRNA的投入量為1 ng-100 ng。若基因的表達豐度很低，最多可投入5 ug Total RNA或500 ng mRNA。
2. 逆轉錄反應體系配制（20 μL體系）
組分 | 使用量 |
RNase-free ddH2O | To 20 μL |
上一步的反應液 | 10 μL |
5× Hifair® Ⅱ Buffer plus | 2 μL* |
Hifair® Ⅱ Enzyme Mix | 2 μL |
Random Primers N6 (50 μM) | 1 μL |
or Oligo (dT)18 (50 μM) or Gene Specific Primers (2 μM) | or 1 μL |
or 1 μL |
【注】：1）逆轉錄引物：熒光定量實驗推薦Random Primers N6與Oligo (dT)18 1:1混合使用。
2）5×Hifair® Ⅱ Buffer plus加入量（*）：因gDNA digester buffer的影響，本體系中只需要加2 μL。
3）建議先加入5×Hifair® Ⅱ Buffer plus混勻后再添加反轉錄引物，以保證*抑制gDNA digester的活性。
3. 逆轉錄程序設置
溫度 | 時間 |
25℃ | 5 min |
42℃ | 30 min |
85℃ | 5 min |
【注】：逆轉錄溫度：推薦使用42℃。對于高GC含量模板或者復雜模板，可將逆轉錄溫度提高到50℃。
4. 逆轉錄產物可以-20℃短期保存，若需長期保存，建議分裝后，于-80℃保存，避免反復凍融。
二、若實驗無需去除基因組DNA
1. 逆轉錄反應體系配制（20 μL體系）
組分 | 使用量 |
RNase-free ddH2O | To 20 μL |
Total RNA | 1 ng -5 μg |
or mRNA | 1 ng-500 ng |
5× Hifair® Ⅱ Buffer plus | 4 μL* |
Oligo (dT)18 (50 μM) or Random Primers N6 (50 μM) | 1 μL |
Hifair® Ⅱ Enzyme Mix | 2 μL |
【注】：1）逆轉錄引物：熒光定量實驗推薦Random Primers N6與Oligo (dT)18 1:1混合使用。
2）5×Hifair® Ⅱ Buffer plus加入量（*）：因無gDNA digester buffer的影響，本體系中需要添加4 μL。
【可選步驟】：針對復雜模板，建議RNA、H2O、反轉錄引物在65℃保溫5 min 后，冰上迅速冷卻。然后再加入反轉錄酶和Buffer。
2. 逆轉錄程序設置參照上述基因組去除后的逆轉錄程序。
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