產品信息

產品描述

Hieff NGS^® Ultima Pro PCR Free DNA Library Prep Kit是針對Illumina^®高通量測序平臺專業開發設計的新一代PCR Free版建庫試劑盒。本產品采用高質量的酶學組成，在前一代建庫試劑盒的基礎上，改進了DNA----片段末端修復和加A效率，同時改善接頭連接效率。可應用于常規動植物基因組、微生物基因組、FFPE、cfDNA、ChIP DNA等樣本，助力獲得優異的測序數據。

1.適用500 pg-500 ng所有DNA樣本，包含cfDNA、FFPE等

2.業界的文庫轉化率，最高可達70%以上

3.多樣本驗證可獲得優異的文庫與測序數據

4.嚴格的批次性能與穩定性質控

產品組分

運輸與保存方法

干冰運輸。所有組分-20 °C保存，有效期1年。

注意事項

一、關于操作

1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 配制各步驟反應液時推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩，劇烈振蕩可能會造成文庫產出下降。

4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時請更換槍頭。

5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應，使用前應預熱PCR儀至反應溫度附近。

6. PCR產物因操作不當極容易產生氣溶膠污染，進而影響實驗結果準確性。推薦將PCR反應體系配制區和PCR產物純化檢測區進行強制性的物理隔離；使用專用的移液器等設備；并定時對各實驗區域進行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進行擦拭清理），以保證實驗環境的潔凈度。

7. 本產品僅作科研用途！

二、關于DNA-----片段化

1. 本試劑盒中兼容機械法及酶切法片段化的DNA。

2. 本試劑盒兼容范圍為500 pg - 500 ng Input DNA。應盡可能使用A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.0的高質量Input DNA。表1中列舉了將本試劑盒應用于常見應用中推薦的Input DNA量。

表1.常見應用中推薦Input DNA量

【注】：上表為使用高質量DNA時推薦的Input DNA量，當Input DNA質量較差或需要進行片段分選時，應適當上調使用量。

3. Input DNA特指投入末端修復/dA尾添加步驟中的DNA。

4. Input DNA制備過程中帶入的高濃度金屬離子螯合劑或其他鹽，可能會影響末端修復/dA尾添加步驟反應效率，建議DNA----片段化后進行磁珠純化或分選。當使用機械法進行DNA----片段化且產物不進行純化或長度分選而直接建庫時，請將DNA稀釋在TE Buffer中進行片段化，請勿在滅菌超純水中進行。當使用酶切法進行片段化且產物不進行純化或長度分選而直接建庫時，請確認Stop Buffer中不包含過量的金屬離子螯合劑。如條件不滿足，可先將片段化產物純化或長度分選后溶于TE buffer或滅菌超純水中（≤50 μL)，再進行文庫構建。

三、關于接頭連接（Adapter Ligation)

1. 針對Illumina^®測序平臺，Yeasen提供48種Barcoded Adapters: Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 4 (Cat#12615~Cat#12618)；單端 96種 Index Primers: Hieff NGS^® 96 Single Index Primers Kit for Illumina^®, Set 1~Set 2 (Cat#12611~Cat#12612)；雙端384 種UDI Primers: Hieff NGS^® Stubby UDI Primer Kit for Illumina^® (Cat#12404~Cat#12407)。

2. Adapter的質量和使用濃度直接影響連接效率及文庫產量。Adapter用量過高可能會產生較多Adapter Dimer；用量較低可能會影響連接效率及文庫產量。表2列舉了使用本試劑盒，不同Input DNA量推薦的Adapter使用量。

表2.500 pg-1 μg Input DNA推薦的Adapter使用濃度

【注】：Input DNA摩爾數 (pmol)≈ Input DNA質量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均長度 (bp)]。

四、關于磁珠純化與分選 (Bead-based Clean Up and Size Selection)

1. DNA----片段長度分選步驟可選擇在末端修復/dA尾添加之前，或接頭連接后，或文庫擴增后進行。

2. 當Input DNA質量≥50 ng，您可選擇在接頭連接后分選；如Input DNA質量<50 ng，建議您在文庫擴增后進行分選。

3. Ligation Enhancer中包含高濃度的PEG，會對雙輪磁珠分選產生顯著影響。因此，如在接頭連接后進行長度分選，必須先進行純化步驟，再進行雙輪分選步驟！；如在末端修復/dA尾添加之前或文庫擴增后進行長度分選，可直接進行雙輪磁珠分選步驟。

4. 磁珠使用前應先平衡至室溫，否則會導致得率下降、分選效果不佳。

5. 磁珠每次使用前都應充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

6. 轉移上清時，請勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續文庫質量。

7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應現用現配，否則將影響回收效率。

8. 進行長度分選時，初始樣品體積應盡量≥100 μL，不足時請用超純水補齊。以防因樣品體積太小導致移液誤差增大。

9. 產物洗脫前應將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續反應；過分干燥又會導致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

10. DNA純化或長度分選產物如需保存，可使用TE Buffer洗脫，產物可于4 °C可保存1-2周，-20 °C可保存1個月。

五、關于文庫質檢 (Library Quality Analysis)

1. 通常情況下，構建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進行質量評價。

2. 文庫濃度檢測可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR絕對定量的方法。

3. 文庫濃度檢測不可使用：基于光譜檢測的方法，如NanoDrop^®等。

4. 推薦使用qPCR方法進行文庫濃度檢測：Qubit^®、PicoGreen^®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法時，無法有效區分單端連接Adapter的產物、兩端均未連接Adapter的產物以及其他不完整雙鏈結構產物；qPCR絕對定量基于PCR擴增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測序的文庫），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫的干擾。

5. 文庫長度分布檢測，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細管電泳或微控流原理的設備進行檢測。

使用方法

一、自備材料

1. 純化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS^® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產品。

2. DNA質控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效產品。

3. DNA Adapter：可選Yeasen Cat#12615，Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1；Cat#12616，Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 2；Cat#12617，Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 3；Cat#12618，Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 4；或其他等效產品。

4. 其他材料：無水乙醇、滅菌超純水、TE Buffer (10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+1 mM EDTA)、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR儀等。

二、操作流程

圖1.Ultima Pro PCR Free DNA建庫試劑盒操作流程

三、操作步驟

3.1 末端修復/dA尾添加 (End Repair/dA-Taling)

該步驟將Input DNA末端補平，并進行5’端磷酸化和3’端加dA尾。

1. 將表4中各試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無菌PCR管中配制表4所示反應體系。

表4.末端修復/dA尾添加PCR反應體系

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應液離心至管底。

4. 將上述PCR管置于PCR儀，設置表5所示反應程序，進行末端修復/dA尾添加反應。

表5.末端修復/dA尾添加PCR反應程序

3.2 接頭連接 (Adapter Ligation)

該步驟將3.1步驟的產物末端，連接特定的Illumina^®接頭。

1. 根據Input DNA量按表2稀釋Adapter至合適濃度。

2. 將表6中各試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

3. 于3.1步驟PCR管中配制表6所示反應體系。

表6.Adapter Ligation PCR體系

【注】：*Ligation Enhancer比較粘稠，請上下顛倒、振蕩，充分混勻并瞬時后離心使用。

**本公司接頭濃度與常規商業化試劑盒一致，皆為15 μM。請根據注意事項三中的提示，對接頭進行稀釋，加水補齊，使接頭體積為5 μL。

【接頭添加計算舉例】：當Input DNA為100 ng，Input DNA長度為300 bp時，接頭應該添加多少？

第一步，計算Input DNA摩爾數。公式：Input DNA摩爾數 (pmol)≈ Input DNA質量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均長度 (bp)]；

Input DNA 摩爾數 (pmol)=100÷ (0.66×300)=0.5 pmol；

第二步，計算接頭添加摩爾數。根據注意事項三表2查詢接頭添加比例；

根據表2，查得Input DNA 100ng時接頭添加比例100:1，則接頭添加摩爾數=100×0.5 pmol=50 pmol；

第三步，計算接頭添加體積。接頭濃度=15 μmol/L（如使用其他接頭，濃度需要依據其他接頭濃度參數）；

接頭添加體積=接頭添加摩爾數 (50 pmol)÷接頭濃度 (15 μmol/L)=3.34 μL（注：15 μmol/L=15 pmol/μL)

綜上，接頭可添加3.4 μL，加1.6 μL水補齊至5 μL。（注：接頭最大加入體積不超過5 μL）。

4. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應液收集至管底。

5. 將PCR管置于PCR儀中，設置表7所示反應程序，進行接頭連接反應：

表7.Adapter Ligation PCR反應程序

【注】：當Input DNA量較低，實驗效果不理想時，可嘗試將連接時間延長一倍。

3.3 連接產物磁珠純化 (Post-Ligation Clean Up)

該步驟使用磁珠對3.2步驟的產物進行純化或分選。純化可除去未連接的Adapter或Adapter Dimer等無效產物。

3.3.1 純化操作步驟：

1. 準備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取60 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads (0.6×，Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation產物中，渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復步驟5，總計漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現龜裂（不超過5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，進行洗脫：

1)如產物無需進行片段分選，直接加入21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。【注：如純化產物如需保存，可使用TE Buffer洗脫】。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約5 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，切勿觸碰磁珠。

2)如產物需進行雙輪分選，加入102 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。【注：如純化產物如需保存，可使用TE Buffer洗脫】。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，切勿觸碰磁珠。

3.3.2 雙輪分選操作步驟：

1. 準備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡約30 min。配制80%乙醇。

2. 請渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證混勻。

3. 根據DNA----片段長度要求，參考表8向上述100 μL DNA上清中加入第一輪分選磁珠，渦旋或移液器吹打10次混勻。

表8.磁珠文庫分選推薦比例

【注】：表中“×"表示樣品DNA體積。如文庫插入片段長度為250 bp，樣品DNA體積為100 μL，則第一輪分選磁珠使用體積為0.70×100 μL=70 μL；第二輪分選磁珠使用體積為0.20×100 μL=20 μL；表中所推薦比例是針對于Adapter Ligated Insert DNA (Post Ligation)，如果用戶在接頭連接前進行分選，請采用Hieff NGS^® DNA Selection Beads (Cat#12601)說明書中推薦的比例。

4. 室溫孵育5 min。

5. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心轉移上清到干凈的離心管中。

6. 參考表8向上清中加入第二輪分選磁珠。

7. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫靜置5 min。

8. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

9. 保持PCR管始終處于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，小心移除上清。

10. 重復步驟9。

11. 保持PCR管始終處于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛剛出現龜裂（約5 min）。

12. 將PCR管從磁力架中取出，加入適量21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置5 min。

13. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約5 min），小心轉移20 μL上清至干凈的管中。

3.4 文庫質量控制

通常情況下，構建好的文庫可通過濃度檢測和長度分布檢測來進行質量評價，具體請參見注意事項六。

HB211026