Cultrex® 3-D Culture Matrix™ 低生長因子基底膜抽提物，PathClear®實驗方案
I. 產品描述
3D細胞培養可為細胞提供必要的結構和信號指令來定向重建組織結構。這一類方法能夠提供體外的生理性預期模型，幫助用戶評估細胞的發育與疾病狀態。正常細胞會聚集為結構類似其來源組織的類器官，進而表現出極化的形態，細胞周期調控現象并表達組織特異性的蛋白1-6。

I. 產品描述

3D細胞培養可為細胞提供必要的結構和信號指令來定向重建組織結構。這一類方法能夠提供體外的生理性預期模型，幫助用戶評估細胞的發育與疾病狀態。正常細胞會聚集為結構類似其來源組織的類器官，進而表現出極化的形態，細胞周期調控現象并表達組織特異性的蛋白^1-6。當癌癥細胞聚集為腫瘤樣結構時，則會基于其惡性程度，表現出組織性結構或細胞周期調控的缺乏，并表達出腫瘤特異性的標記物^7-9。

為了幫助用戶發揮本技術的優勢，我們推出了Cultrex^® 3-D Culture Matrix^™ RGF BME產品，這款產品是*基底膜抽提物產品，經過3D培養效果驗證，專為滿足三維培養研究的需求而研制，。3-D Culture Matrix^™ RGF BME能夠為細胞提供三維生長基礎，幫助其在體外形成特定結構。為了提供標準化的3D培養基底膜抽提物產品，采用一套特殊工藝來降低生長因子，并將基質的標準濃度控制在15 mg/ml左右，。隨后在三維培養條件下對本品的效能進行了評估驗證。

II. 規格說明

1. 濃度：14 - 16 mg/ml。

2. 來源：嚙齒類Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）腫瘤

3. 儲存緩沖液：不含酚紅的DMEM培養基 （貨號 D5030），10 μg/ml 硫酸慶大霉素 （貨號 G1264）

III. 未隨附的必要試劑與儀器

1. 設備

1. 層流罩

2. 37 °C CO₂ 培養箱

3. 用于收集細胞的低速旋轉4 °C離心機與離心管

4. 計數器或用于細胞計數的其它設備

5. -20 °C儲存設備

6. 冰桶

7. 移液器與吸管輔助器

8. 帶有4X物鏡與數字攝像機的明場顯微鏡

2. 試劑

1. 感興趣的細胞系

2. 細胞收集緩沖液；EDTA，胰蛋白酶，或其他細胞解離緩沖液

3. 組織培養生長培養基

4. 培養基中可能需要添加的藥理學試劑

5. 用于潤洗細胞的磷酸鹽緩沖液 （貨號 P5493）

6. 固定用福爾馬林 （貨號 F5554）

3. 耗材

1. Greiner培養瓶, TC處理，25 cm² （貨號 C6231）或75 cm² （貨號 C7106）規格

2. Sigma^® 離心管， 10 ml（貨號 SIAL0790）與50 ml（貨號 SIAL0828）規格

3. Sigma^® 血清學移液器，1，5和10 ml（貨號 SIAL1485， SIAL1487， SIAL1488）規格

4. 手套

IV. 注意事項與使用限制

1. 僅用于研究用途，不適用于診斷操作流程。

2. 這些產品的物理、化學和毒理學性質可能尚未經過充分研究；因此，我們建議用戶在使用這些化學試劑的過程中佩戴手套、實驗服和護目鏡。

V. 材料鑒定

1. 功能檢測

1. 小管形成分析 - BME可促進人（HBMVEC、HUVEC）或小鼠（SVEC4-10）內皮細胞形成毛細管樣結構。

2. 3D培養 - 基底膜抽提物可促進乳腺（MCF-10A）或前列腺（PC-3）源人上皮細胞系的分化，進而形成腺泡結構。

2. 無菌檢測

1. PathClear^® –PCR檢測顯示支原體陰性；小鼠抗體生產（MAP）檢測通常涵蓋了17種細菌和病毒株檢測，以及包括LDEV在內的13個附加鼠類感染源檢測項目，合計檢測31個物種/病毒。

2. 根據USP無菌測試流程，在37 °C下孵育14天，未檢測到細菌或病毒生長現象。

3. LAL分析結果顯示內毒素濃度≤8 EU/ml

3. 膠凝作用分析

1. 在37 ?°C條件下，BME會在30分鐘之內形成凝膠，并能在37 ?C下的培養基中至少維持14天凝膠狀態。

VI. 儲存與穩定性

于–20 ?C的手動除霜冰箱條件下保存時，產品可在發貨后三月內保持穩定。如需獲得更好的穩定性，請于–80 ?C條件下儲藏。請避免反復凍融。

VII.3D培養方案

本方案需在層流柜或無菌室等潔凈環境下進行，用戶需使用無菌技術以避免污染。本實驗方案基于Debnath 等的方法¹ 。該方法是經過充分驗證的實例；不同的細胞系需要不同的細胞培養條件和孵育時長。

1. 按照細胞供應商的建議培養細胞，以便在37 ?C的CO₂ 培養箱中形成穩定的細胞群；生長培養基，生長因子、血清要求和培養時長可能隨細胞類型而變化；此處以MCF-10A（DMEM，5%馬血清（HS），20 ng/ml hEGF，500 ng/ml qing hua ke di song，100 ng/ml霍亂毒素，10 μg/ml胰島素，1X青霉素/鏈霉素)與PC-3（RPMI-1640，10% HS，5%胎牛血清（FBS）為例。

2. 請在2-8 ?C條件下過夜解凍3-D Culture Matrix^™ RGF BME。

3. 在冰上進行操作，向無菌48孔板的每個反應孔中加入250 μl 3-D Culture Matrix^™ RGF BME，在37 ?C條件下孵育平板30分鐘以促進基質凝膠化。

4. 在冰上進行操作，向無菌的培養容器中加入98 ml生長培養基（按照細胞供應商推薦的方法）與2 ml 3-D Culture Matrix^™ RGF BME（終濃度為2%），并在容器上標記“Assay Media（分析培養基）"，然后旋轉混勻。未用的3-D Culture Matrix^™ RGF BME可在4 ?C條件下儲存一周，或在-20°C手動除霜冰箱中（按工作用量）分裝保存。

5. 制備細胞稀釋液之前，在37?C條件下孵育Assay Media（分析培養基）30分鐘。

6. 從培養物中采集細胞，并使用24 ml分析培養基將這些細胞稀釋至1 x 10⁴ 細胞/ml。

7. 向含有3-D Culture Matrix^™ RGF BME的48孔板中加入細胞懸液，每孔500 μl。

8. CO₂ 培養箱中，37 ?C條件下過夜孵育平板。

9. 每天通過倒置顯微鏡觀察細胞生長與結構形成情況，之后重新將48孔板放置于CO₂ 培養箱中37 ?C孵育過夜。

10. 在第4天，用無菌的血清移液器小心吸去原培養基，并更換全新的Assay Media。在第8天和第12天重復此操作。

11. 當團塊結構生長至所需的大小后，制備分析用細胞（按照生產商的建議），并對其進行結構分析。這一采樣時間點取決于所用的細胞系和生長條件。根據我們的標準，MCF-10A細胞應在第16天進行分析，PC-3細胞應該10-12天時進行分析。

分析建議

1. 固定細胞時，在含2%福爾馬林的1X PBS中室溫孵育20分鐘。

2. 可在含有BME的平板中分析細胞；也可將其（非常小心地）轉移至顯微鏡玻片上；或使用石蠟對樣本進行包埋和切片。

圖1. 三維細胞結構。在3-D Culture Matrix^™ RGF BME中培養16天后，對MCF-10A細胞進行染色：A）細胞染色試劑盒（結構）；B）SYBR^®Green（細胞核）；C）MitoShift^™（線粒體膜電位）； 3-D Culture Matrix^™ RGF BME中培養12天后，對PC-3細胞進行染色：D）Calcein AM（細胞活力）；E）CPA染料1（細胞核）；F）Depsipher^™（線粒體膜電位）

法律信息

3-D Culture Matrix is a trademark of Trevigen, Inc.

Cultrex and PathClear are registered trademarks of Trevigen, Inc.

SYBR is a registered trademark of Molecular Probes, Eugene OR

Depsipher and MitoShift are trademarks of Trevigen, Inc.

材料

參考文獻

1. Debnath J, Muthuswamy SK, Brugge JS. 2003. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. Jul; 30(3):256-68.

2. Webber MM, Bello D, Kleinman HK, and Hoffman MP. 1997. Acinar differentiation by non-malignant immortalized human prostate epithelial cells and its loss in malignant cells. Carcinogenesis. 18(6): 1225-1231.

3. Fong CJ, Sherwood ER, Sutkowski DM, Abu-Jawdeh GM, Yokoo H, Bauer KD, Kozlowski JM, and Lee C.1991. Reconstituted basement membrane promotes morphological and functional differentiation of primary human prostate epithelial cells. Prostate. 19(3): 221-235.

4. Lang SH, Sharrard RM, Stark M, Villette JM, and Maitland NJ. 2001. Prostate epitheial cell lines form spheroids with evidence of glandular differentiation in three-dimensional Matrigel cultures. Br J Cancer. 85(4): pp. 590-599.

5. Taub, M, Wang Y, Szczesny T, and Kleinman H. 1990. Epidermal growth factor or transforming growth factor β is required for kidney tubulogenesis in matrigel cultures in serum-free medium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4002-4006.

6. Kubota Y, Kleinman H, Martin G, and Lawley T. 1988. Role of laminin and basement membrane proteins in the morphological differentiation of human endothelial cells in capillary-like structures. J. Cell Biol. 107:1589-1598.

7. Kenny, P.A., et al., 2007. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol Oncol, 1(1): p. 84-96.

8. Harma, V., et al., A 2010. Comprehensive Panel of Three-Dimensional Models for Studies of Prostate Cancer Growth, Invasion and Drug Responses. PLoS ONE, 5(5): p. e10431.

9. Fridman, R., G. Giaccone, T. Kanemoto, G. Martin, A. Gazdar, and J. Mulshine. 1990. Reconstituted basement membrane (matrigel) and laminin can enhance the tumorigenicity and the drug resistance of small cell lung cancer cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6698-6702.

10. Ponce M., Nomizu M, Delgado M, Kuratomi V, Hoffman M, Powell S, Yamada Y, Kleinman H, and Malinda K. 1999. Identification of endothelial cell binding sites on the laminin g1 chain. Circ. Res. 84:688-694.

11. Benton, G., J. George, H.K. Kleinman, and I.P. Arnaoutova. 2009. Advancing Science and Technology Via 3D Culture on Basement Membrane Matrix. J. Cell. Physiol. 221:18-25.

12. Benton G, Kleinman HK, George J, Arnaoutova I. 2011. Multiple uses of basement membrane matrix (BME/Matrigel) in vitro and in vivo with tumor cells. Int. J. Cancer. 128 (8); 1751-1757.