1由強到弱

一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進行試驗，這樣可以很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機溶劑(乙腈或甲醇)的比例。    

2三倍規(guī)則 

每減少10%的有機溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則。這是一個聰明而又省力的辦法。調(diào)整的過程中，注意觀察各個峰的分離情況。    

3粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)

當(dāng)分離達到一定程度，應(yīng)將有機溶劑10%的改變量調(diào)整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率，直至各組分的分離情況不再改變。

1、流動相的性質(zhì)要求一個理想的液相色譜流動相溶劑應(yīng)具有低粘度、與檢測器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。選擇流動相時應(yīng)考慮以下幾個方面：
①流動相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)。低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時遇到某些有機相會溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。
②純度。色譜柱的壽命與大量流動相通過有關(guān)，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時。
③必須與檢測器匹配。使用UV檢測器時，所用流動相在檢測波長下應(yīng)沒有吸收，或吸收很小。當(dāng)使用示差折光檢測器時，應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動相，以提高靈敏度。
④粘度要低（應(yīng)<2cp）。高粘度溶劑會影響溶質(zhì)的擴散、傳質(zhì)，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時間延長。最好選擇沸點在100℃以下的流動相。
⑤對樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會使柱子惡化。
⑥樣品易于回收。應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。

2．流動相的pH值采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時，通過調(diào)節(jié)流動相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術(shù)稱為反相離子抑制技術(shù)。對于弱酸，流動相的pH值越小，組分的k值越大，當(dāng)pH值遠遠小于弱酸的pKa值時，弱酸主要以分子形式存在；對弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時，通常在流動相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。注：流動相中加入有機胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。所以在這種情況下有機胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。
三乙胺triethylamine  氨分子中的氫原子被3個乙基取代的產(chǎn)物。分子式(CH3CH2)3N。易揮發(fā)的無色液體，有氨的氣味。熔點－114.7℃，沸點89.3℃，相對密度0.7275（20／4℃）。溶于水和乙醇等有機溶劑。三乙胺有堿性，與無機酸能生成易溶于水的鹽類。可由N，N- 二乙基乙酰氨與氫化鋁鋰反應(yīng)制取，也可用乙醇胺進行氣相烷基化反應(yīng)合成。用于制橡膠硫化促進劑、潤濕劑和殺菌劑等，也可用作溶劑和用于合成四級銨化合物。

3. 如何選擇緩沖液PH值在選擇緩沖液PH值之前，應(yīng)先了解被分析物的Pka，高于或低于Pka兩個PH值單位的，有助于獲得好的、尖銳的峰，從HH公式：PH＝Pka＋log（[A-]/[A]）得知，溶液PH值高于或低于Pka兩個單位，化合物中99％以一種形式存在，而一種形式存在的化合物才能獲得好的尖銳的峰。顯示的是它的離子形式和中性化合物的轉(zhuǎn)變，苯甲酸的Pka等于4.2，理論上由HH公示得知，當(dāng)溶液PH值等于2.2時，99％的苯甲酸以中性化合物存在，PH值等于6.2時99%的苯甲酸以離子形式存在，所以當(dāng)緩沖液PH值等于2.2時，中性化合物以羧酸形式保留于反相柱。

4．流動相的脫氣HPLC所用流動相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚至使無法檢測。（噪聲增大，基線不穩(wěn)，突然跳動）。
此外，溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相（如烷基胺）反應(yīng)。溶解氣體還會引起溶劑pH的變化，對分離或分析結(jié)果帶來誤差。溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡(luò)合物，此絡(luò)合物會提高背景吸收（特別是在260nm以下），并導(dǎo)致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會在梯度淋洗時造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會引起淬滅現(xiàn)象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應(yīng)可降低達95%。在電化學(xué)檢測中（特別是還原電化學(xué)法），氧的影響更大。
除去流動相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應(yīng)用中的靈敏度。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點溶劑揮發(fā)造成的組成變化。超聲脫氣比較好，10~20分鐘的超聲處理對許多有機溶劑或有機溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500ml溶液需超聲20~30min方可），此法不影響溶劑組成。超聲時應(yīng)注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內(nèi)液面不要高出水面太多。離線（系統(tǒng)外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態(tài)，在你停止脫氣后，氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時內(nèi)，溶劑又將被環(huán)境氣體所飽和。
在線（系統(tǒng)內(nèi)）脫氣法無此缺點。在線脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進行時，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴格來說，此方法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體（通常是氦）將空氣替換出來。此外還有在線脫氣機。
一般說來有機溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當(dāng)有效的脫氣方法，這種連續(xù)脫氣法在電化學(xué)檢測時經(jīng)常使用。但氦氣昂貴，難于普及。

5．流動相的濾過所有溶劑使用前都必須經(jīng)0.45µm（或0.22µm）濾過，以除去雜質(zhì)微粒，色譜純試劑也不例外（除非在標簽上標明“已濾過"）。用濾膜過濾時，特別要注意分清有機相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）濾膜。有機相濾膜一般用于過濾有機溶劑，過濾水溶液時流速低或濾不動。水相濾膜只能用于過濾水溶液，嚴禁用于有機溶劑，否則濾膜會被溶解！溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC。對于混合流動相，可在混合前分別濾過，如需混合后濾過，有機相濾膜。現(xiàn)在已有混合型濾膜出售。

6．流動相的貯存流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導(dǎo)致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統(tǒng)，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。
磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉，應(yīng)盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內(nèi)冷藏，并在3天內(nèi)使用，用前應(yīng)重新濾過。容器應(yīng)定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現(xiàn)象。

7．鹵代有機溶劑應(yīng)特別注意的問題鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質(zhì)，能與HPLC系統(tǒng)中的不銹鋼反應(yīng)。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解，不能存放太久。鹵代溶劑（如CCl4、CHCl3等）與各種醚類（如二異丙醚、四氫呋喃等）混合后，可能會反應(yīng)生成一些對不銹鋼有較大腐蝕性的產(chǎn)物，這種混合流動相應(yīng)盡量不采用，或新鮮配制。此外，鹵代溶劑（如CH2Cl2）與一些反應(yīng)性有機溶劑（如乙腈）混合靜置時，還會產(chǎn)生結(jié)晶。總之，鹵代溶劑最好新鮮配制使用。如果是和干燥的飽和烷烴混合，則不會產(chǎn)生類似問題。

4流動相溶劑的選擇

1.所選用的流動相溶劑要有一定的化學(xué)穩(wěn)定性，不與固定相和樣品組分起反應(yīng)，其純度和化學(xué)特性必須滿足色譜過程的穩(wěn)定性和重復(fù)性的要求。

2.溶劑應(yīng)當(dāng)不干擾檢測器的工作，溶劑應(yīng)與檢測器匹配，選擇不影響檢測器正常工作應(yīng)選擇在測定波長范圍內(nèi)無吸收的流動相。

3.在制備分離中, 溶劑應(yīng)當(dāng)易于除去, 不干擾對分離組分的回收。

4.溶劑的粘度要小，保證合適的柱壓降。

5.從實用角度考慮，溶劑應(yīng)當(dāng)價格低廉，容易購得，使用安全，純度要高。

5流動相溶劑使用的注意事項

1.流動相溶劑應(yīng)選擇HPLC的溶劑或依此為標準的溶劑。流動相使用前用0.45μm濾膜過濾、脫氣，清除微粒和灰塵。在送液泵內(nèi)，為了防止雜物（固體）進入流路，裝有吸濾器，但網(wǎng)孔徑為10μm，比此更小的顆粒仍然可通過，這會導(dǎo)致流路和柱子堵塞和污染。為此，建議常用0.45μm濾膜過濾。流動相溶劑須經(jīng)脫氣，如不脫氣，在溶劑混合時，或壓力溫度變化時容易產(chǎn)生大量氣泡，會導(dǎo)致泵誤動作和輸液不暢，檢測器產(chǎn)生噪聲信號等。

2.流動相恢復(fù)到室溫后使用。流動相溫度與室溫相差時，流動相在恢復(fù)到室溫前，基線水平很難穩(wěn)定，特別是發(fā)生漂移，也容易產(chǎn)生氣泡等現(xiàn)象。水與有機溶劑混合時，混合液變化大，往往會與室溫相差很大，務(wù)必注意。

3.做HPLC流動相的試劑應(yīng)用HPLC級的、水應(yīng)用二次蒸餾水，水相流動相需經(jīng)常更換，防止長菌變質(zhì)。使用去離子水、針劑水、純凈水（炊用）并不合適、尤其是做梯度洗脫時，水中的不純物會成為鬼峰，從而干擾分析結(jié)果。

4.流動相的pH值過高或過低，流動相使用純水，使用高濃度磷酸鹽緩沖溶液，使用離子對試劑等，均可能造成色譜柱填料被化學(xué)破壞，這種對色譜柱固定相及鍵合相的破壞通常是不可修復(fù)的。

5.用緩沖鹽做流動相時，在使用前和使用后都要用水清洗流路，絕對禁止將緩沖溶液留在流路中靜置過夜或更長時間。

6.若需要使用含鹽的流動相，使用前請過濾。并且使用該含鹽流動相前，色譜柱需先用低比例有機相（有機相含量應(yīng)不低于10%）的溶液沖洗，以免緩沖鹽析出。流動相若為蒸餾水或含鹽的緩沖液，建議現(xiàn)用現(xiàn)配，以免流動相因滋生微生物而造成柱填料的污染。

7.進行梯度實驗時要注意梯度變化過程中流動相的互溶性，避免因流動相不互溶而導(dǎo)致的緩沖鹽析出問題。反相系統(tǒng)更換正相系統(tǒng)或正相系統(tǒng)更換反相系統(tǒng)時，用異丙醇置換系統(tǒng)內(nèi)的儲存流動相后在接柱子。

8.在更換兩種互不相溶的流動相時，中間要用異丙醇溶液清洗過渡。例如：先用甲醇水做流動相，然后在用正己烷做流動相時，一定要先用異丙醇溶液沖洗甲醇水，然后用正己烷沖洗異丙醇，反之也是一樣。在更換流動相時還要考慮色譜柱是否更換。

9.儀器在短期（兩三天）不用時，流路中可以是甲醇或水。儀器在長期不用時，流路中應(yīng)用甲醇。

10.對于UV等檢測器用于高靈敏度檢測時，要使用UV吸收性小的HPLC的溶劑作為流動相溶劑，如甲醇、乙腈等。

11.當(dāng)流動相溶劑為乙腈時，流速為1ml/min泵的正常壓力5～7Mpa之間，如果壓力逐漸降低，基線也出現(xiàn)異常。這是由于乙氰的粘性大，導(dǎo)致泵的流速降低。可適當(dāng)提高流速使泵的壓力恢復(fù)正常即可。

12.流動相含有濃硫酸、濃硝酸、二氯甲烷、氯仿、丙酮、四氯呋南、二甲化砜等溶劑，會對流路中的PEEK樹脂管路強度變成差、PEEK樹脂管容易破裂使溶劑外濺。流動相含有鹵素離子的溶劑，如KCI、NaCI、NH4CI等。對流路中的不銹鋼材料有腐蝕作用，以上的溶劑須盡量避免使用。非用不可時，分析完了后，應(yīng)立刻用蒸餾水把全流路清洗干凈。

13.用于檢定梯度等性能時，短時間使用在0.5%以下的低濃度丙酮水溶液是沒有問題的。

14.注意：稀硝酸與甲醇不能混合，否則有可能會引起爆炸。

06液相色譜流動相的貯存

流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導(dǎo)致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統(tǒng)，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。

磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉，應(yīng)盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內(nèi)冷藏，并在3天內(nèi)使用，用前應(yīng)重新濾過。容器應(yīng)定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現(xiàn)象。