原料藥中的雜質包括有機雜質（工藝和藥物相關的）、無機雜質和殘留溶劑。其中有機雜質就是一般我們所指的有關物質，是指在藥物生產過程/貯存中所引入/生成的起始物料、中間體、副產物、異構體、降解物、催化劑等1；藥物制劑的有關物質主要是指藥物自身的降解物以及藥物與輔料或包裝材料相容性產物等2。有關物質可能會具有不確定的毒性，甚至潛在的致癌、致畸、致突變等性質，因此需嚴格控制。

       國內外藥典中很多品種有關物質檢測方法通過峰面積比較的方法來確定是否符合規定，這種方法忽略了供試品溶液和對照品溶液的實際濃度，是一種xian量檢測的方法。但這種xian量方法有相當的局限性：一是忽略了實際濃度會導致測定數據的準確性降低，二是無法統計出有關物質的穩定性變化趨勢和樣品的批間差異。越來越明顯的趨勢表明，國外更多的品種正以定量的檢驗方法來代替xian量的檢驗方法，本文的目的就是以定量的方法來說明有關物質檢驗方法的建立、驗證和檢驗的要求。
由于藥物和有關物質本身一般都是有機物，且具有相類似的化學結構，因此具有專屬性（穩定性指示性）和準確性高的HPLC法就作為了有關物質檢驗的方法。本文將針對HPLC法檢驗有關物質方法的建立、驗證和檢驗與大家作一個探討。

一、有關物質檢驗方法的建立

       首先需要說明的是，任何一種檢驗方法都不可能是萬能的，HPLC法也是一樣，一般有兩個大的缺陷：一是HPLC檢驗的圖譜不是一個“全譜"，也就是說一個HPLC方法并不會像TLC方法一樣把所有的雜質都會同時檢驗出來，尤其是國內現在使用較多的恒流的色譜方法，極性相差較大的化合物很難在一個色譜條件下檢出；二是有一些雜質在檢驗條件下沒有響應，例如一些化合物的原料/中間體/副產物沒有紫外吸收，使用紫外檢驗器是無法檢驗到的。因此在建立有關物質的檢驗方法時，往往需要針對不同的已知雜質建立特定的檢驗方法，作為有關物質檢驗方法的補充，這個方法即可能是HPLC法，也可能是TLC法，甚至可能是紫外法或滴定法等等，需要說明的是，對于此類雜質在總雜質計算中不應被重復計算。
      有關物質HPLC檢驗方法在建立時需考慮到在該色譜條件下是否所有潛在的雜質都能被檢出、各雜質的響應值是否合適、有關物質與含量之間的質量守衡（Mass Balance，即理論上含量降低多少有關物質就應該增加多少）。
很多人在有關物質檢驗方法建立時參考的是含量測定的方法甚至是血藥濃度測定的方法，往往這是不合適的，因為這些方法都是針對主成分的測定方法，它不會去考慮雜質的檢出情況和準確性，只需要不干擾主成分的測定即可，而且往往在含量測定的濃度下雜質不能夠檢出，因此無論是流動相的組成還是檢驗波長，可能都不適合有關物質的測定。
      由于制劑有關物質的檢驗重點是降解物和相容性產物，因此原料藥生產工藝雜質（包括原料、中間體、副產物等），如果不是降解物的話，都不是制劑有關物質重點關注的內容，在制劑質量標準中甚至可以不訂入2。因此制劑有關物質的檢驗方法很可能與原料藥會有所不同，這時需對原料藥中可能存在的工藝雜質進行重新定位，這也是方法建立和專屬性驗證的一部分。
有關物質HPLC檢驗方法的建立主要有四個關鍵點：色譜柱的選擇、流動相的組成、檢驗條件的選擇、雜質測定的方法。下面我將從這四點出發說明有關物質是如何建立的。

1、色譜柱的選擇
       根據主成分和雜質的化學性質，選擇合適的色譜柱，使其能夠盡可能在一個色譜條件下檢驗所有雜質。在選擇時往往極性強化合物選擇極性色譜柱、極性弱的化合物選擇非極性色譜柱，但由于成本和環保的原因，除極性非常強的化合物外（例如糖），一般我們選擇非極性色譜柱（例如C18）。
       即使相同類型的色譜柱，由于品牌、規格、型號等差異，色譜柱的保留行為可能會有很大差異，因此在檢驗時應盡可能固定這些參數。

2、流動相的組成
       流動相的組成往往取決于色譜柱的選擇，在色譜柱選定后，通過調節流動相中各組分的比例、pH值、緩沖鹽（包括離子對）的種類/濃度等條件，使主成分和雜質能夠分離并在一個條件下檢驗，必要時應使用梯度。
緩沖鹽，特別是離子對試劑，各廠家的質量差別比較大，因此在使用時應盡可能使用固定的可靠的品牌。

3、檢驗條件的選擇
      選擇合適的檢驗器是有關物質檢驗的一個重點，各種類型的檢驗器都有各自的優缺點。例如紫外檢驗器的優點是成本低、適用性廣、操作簡單，缺點是紫檢驗器為非質量型，各雜質和主成分的響應值可能會差別非常大；而蒸發光散射檢驗器的優點為它是質量型檢驗器，各雜質與主成分的響應值比較接近，缺點是價格比較高、非揮發性流動相不能使用、檢驗結果非線性。
       作為紫外檢驗器，有關物質檢驗波長的選擇非常關鍵，這一方面決定了是否所有潛在雜質能夠檢出，同時也決定了檢驗時是否可以采用主成分對照的方法測定（本文中所說的對照既可指主成分對照品，也可指主成分自身對照）。
4、雜質測定的方法
       通常只有校正因子在0.9～1.1時才可以使用主成分對照的方法（國外由于有關物質標準制定得比較嚴格，所以校正因子在0.8～1.2時仍可以使用主成分對照的方法），校正因子超過此范圍的雜質應選擇外標法或校正因子的方法測定。
       校正因子一般是通過同時進行雜質和主成分的線性測定（線性濃度范圍通常是從報告閾值或定量限到雜質限度或對照濃度的120%～150%），再用主成分的斜率除以雜質的斜率而得出，在計算時將雜質峰面積與校正因子相乘即可。校正因子的概念與EP中的概念相同，與USP中的相對響應因子互為倒數，因此在使用中一定要注意。

二、有關物質檢驗方法的驗證
       根據對藥典的理解，相當大多數的研發人員和檢驗人員認為有關物質檢驗方法應該是一個xian量檢驗方法，驗證可以按照xian量的方法進行。但這種理解是不合適的，我從以下幾個方面來論述有關物質（起碼是限度超過報告閾值的有關物質）應按定量方式進行驗證和檢驗的：

A、對于外標的檢驗方法例如含量，樣品稱量要求“精密稱定"，以代入濃度進行計算；xian量法只需要“稱取"一定范圍內的樣品即可，因為稱量結果并不代入計算，也就是說樣品的稱量范圍控制在較小的范圍內（不是百分之十），只要在范圍內，實際稱量值已不影響檢測結果。在有關物質檢驗中，往往要求供試品和對照品稱量“精密稱定"。
B、從趨勢分析的角度來說，采用xian量法無法對穩定性結果和年度質量回顧進行雜質的趨勢統計和分析。
C、ICH Q3A和Q3B兩部分均有描述，定量限不得高于報告閾值，即需要報告的雜質具備定量的條件。
D、ICH Q3A和Q3B兩部分對于雜質的描述，對于數據的報告，均采用數據的方式，應為定量計算而得出的。
E、USP3等國外藥典中要求未知雜質的限度為不得過0.1%，ICH Q3A和Q3B也要求超過鑒定閾值（一般為0.10%）的雜質必須鑒定，檢驗時必須采取先修約后判定，這是xian量法所不需要的。

F、USP4和EP5附錄中對于有關物質的積分、計算和報告，也說明了其檢驗方法應為定量的。

       綜上所述，有關物質檢驗宜采用定量測定的方法，對應的方案驗證也應采用定量的方法（限度低于報告閾值的雜質可采用xian量測定/驗證），即需要進行專屬性、準確性、精密度、定量限、線性/范圍、耐受性等幾方面的驗證6，同時需進行系統適用性的考查。

下面我從驗證的幾大模塊分別闡述有關物質檢驗方法的驗證要求。

1、專屬性
       專屬性主要的要求就是溶劑、主成分和輔料等對雜質檢驗沒有干擾。
       對于溶劑干擾主要為在溶劑峰位置與潛在雜質峰是否重疊，以及溶劑峰是否影響雜質峰的正常積分。
      對于主成分干擾，需要考查已知雜質和強制降解峰是否與主峰重疊，一般需要采用二極管陣列檢驗器證明主成分峰的純度。除了峰純度外，在強制降解試驗中，需要考查質量平衡，即在主成分含量降低約10%～20%情況下，含量降低值與有關物質絕對增加值的偏差不超過5%，否則說明有關物質的檢驗方法不適用，有些雜質未檢出，或者有些雜質的校正因子不準確。
      對于輔料干擾，需要考查已知雜質/降解物峰與輔料峰能夠識別并充分分離，以確保雜質能夠*、準確的檢驗。這里需要說明的是，“把輔料峰算成雜質峰也是合格的"這種理論是*不對的，輔料峰是不能被計入雜質峰的，因為雜質是被要求準確、定量的。
       對于原輔料有關物質檢測，必要時應使用成品有關物質的檢驗方法進行中間體粗品的考查，以確定中間體的雜質在主成分中殘留的情況。

2、準確性
      由于有關物質相對濃度較低，因此對于準確性要求也并不像含量測定要求那樣高，但也有其特殊性，即回收率計算方法應與檢驗方法一致。也就是說，如果檢驗方法規定為外標法，則回收率計算時應采用外標法；如果檢驗方法規定為校正因子法，則回收率計算時應采用校正因子法；如果檢驗方法規定為主成分對照法，則回收率計算時應采用主成分對照法。否則一概采用外標法計算是沒有任何意義的！
      有關物質準確性驗證一般采用加樣回收法，分別驗證報告閾值、限度值和限度值120%～150%三個濃度水平下的回收率。在試驗時，分別配制相應的對照溶液、供試品溶液和三個雜質濃度水平的加標供試品溶液，計算時分別測定供試品加標前后特定雜質的量，扣除供試品中含有的雜質的量，計算回收率。
      一般在報告閾值水平，回收率可接受標準為80%～120%；0.5%～1.0%含量水平的雜質，回收率可接受標準為95.0%～105.0%。

3、精密度
       由于供試品中的雜質種類、數目和含量，與工藝和批間差異有很大影響，因此對于超過報告閾值的雜質，精密度驗證可以通過配制多份平行樣品進行測定；而對于供試品中不含/含量低于報告閾值的雜質，可以通過計算不同濃度水平回收率的RSD來得出。
       精密度驗證時，測定方法同樣應按照規定的方法進行。

4、定量限和檢出限
       按照ICH Q2的要求，定量限和檢驗限一般有三種測定方法，但在實際HPLC方法中應用多的是信噪比法，即定量限為信噪比10:1、檢驗限為信噪比2～3:1時被測物的進樣量。但在實際中往往這種測定方式是沒有意義的，因為信噪比決定于被測物的峰高和噪音的波動大小，不同的儀器、峰保留時間、儀器狀態、流動相配制、甚至室溫，都可能會嚴重影響信噪比的測定結果，甚至可能是不同數量級的差別7，因此定量限/檢驗限不應只在驗證時進行，在檢驗中同樣也需要進行確認，并作為系統適用性試驗的一部分，以保證檢驗結果的準確性。
      如果說這種定量限/檢驗限的驗證方法不適合，那么怎么樣去進行定量限的驗證呢？根據ICH Q3A和Q3B的要求，定量限不得高于報告閾值，因此我們通常按照報告閾值相對濃度配制成相應的對照品溶液，在進樣檢驗，要求其信噪比不得低于10:1（對于xian量檢驗，要求按照限度值配制的對照品溶液的信噪比不得低于3:1）。這種溶液同樣在有關物質檢驗中也應當考查，如果信噪比沒有通過，則系統適用性試驗沒有通過，需要通過更換流動相/色譜柱/色譜儀等方法來解決。
       定量限及以上的雜質可以定量檢驗，因此定量限驗證除需滿足信噪比的要求外，還應滿足重復性的要求，一般連續進樣六針，其峰面積的RSD不得過10%。

5、線性/范圍
       一般至少五個點，從定量限到限度值的120%～150%，上限不宜過高，否則線性斜率會發生漂移，相關系數至少為0.99，面積歸一化法至少為0.999。如果定量限和限度值150%回收率通過，可不必考查Y軸截距與斜率的比值。

6、耐受性

有關物質一般不宜做較大范圍的變化，尤其是梯度的方法，可重點關注相同規格不同品牌的色譜柱之間的耐受性，其他例如流動相比例±2%、pH±0.1、柱溫±5℃也需要關注。
      在耐受性試驗中需要考查不同條件下主要雜質的數目、相對保留時間和檢驗結果是否可以接受，也要考查系統適用性試驗是否能夠通過。
      溶液穩定性也可以作為耐受性的一部分，這里既需要考查供試品溶液的穩定性，也需要考查對照溶液的穩定性。溶液穩定性是檢驗結果是否有效的基本依據，也會實驗室調查提供了可能。對于有光敏感的樣品必要時也應考查光穩定性。

7、系統適用性試驗

系統適用性試驗是色譜檢驗的基本要求，如果沒有通過表明系統沒有能夠達到檢驗的要求，所產生的數據也是無效的。
      有關物質檢驗中常見的系統適用性試驗一般為重復性和分離度考查。重復性一般是通過連續進樣對照溶液/系統適用性溶液（一般為五針或六針），計算峰面積的RSD得出的，一般0.1%雜質溶液的RSD不得過10%、0.5%～1.0%雜質溶液的RSD不得過5.0%、1.0%以上雜質溶液的RSD不得過2.0%；由于國外對雜質研究得比較細，往往分離度測定是通過配制專門含有特定雜質的對照品溶液/系統適用性溶液/分離度溶液，再進樣檢驗完成的，而國內由于對雜質研究比較粗，往往是通過觀察供試品溶液的圖譜來完成的。

      好的系統適用性試驗，除分離度和重復性檢測外，還包括每次的定量限溶液測定，即配制的定量限溶液的信噪比應不低于10:1。
三、有關物質檢驗方法的檢驗
通過以上內容，可以得出結論：有關物質檢驗宜定量檢驗。因此在檢驗中需要注意以下幾個方法的內容：
1、系統適用性要求
同以上驗證部分的相關要求。
2、小峰面積的設定
在一些藥典或標準中有這樣的描述：“小于對照品溶液主峰面積0.5倍的忽略不計"，這實際上是指雜質的報告閾值，而并不能當作小峰面積。因為雜質檢測是定量測定的，檢測結果是通過計算后再修約得到的，如果按照此峰面積設置小峰面積，則有一部分峰面積略小于設定值的雜質不會被積出，進而造成漏檢，例如小峰面積設定為100，則峰面積為99的雜質不會被積出，但二者的計算結果可能都是0.05%。那么是不是小峰面積設置得越小甚至是0才好呢？也不是，這樣會造成非常小的峰甚至小于檢測限的峰也被積出，影響結果的計算。參考EP和新的USP對于色譜法測定有關物質的要求，小峰面積一般設置為不超過報告閾值的一半4,5，但在結果的報告中，只有超過報告閾值的雜質才被報告和計入總雜質。這也是同一份樣品在不同實驗室中的檢測結果可能存在巨大差別的重要原因。
而對于有雜質采用校正因子法測定的方法時，也應適當設置降低小峰面積，以保證略小于報告閾值的雜質能夠得以正常積分、計算、修約甚至報告。
3、與主峰不能*分離雜質的積分

在很多檢驗中會有主峰與雜質峰不能*分離的情況，這時積分就非常重要了，一般系統默認的方法都是將相鄰峰沿谷底進行垂直分割，這樣會造成雜質峰內含有大量的主成分在里面，這時應采用谷-谷積分（或者采用切線積分）4,5的方式進行積分，以保證雜質峰內不包含主成分，而由于主萬分濃度遠大于雜質，因此也可以確保積分后剩余的三角形中不包含雜質（切線積分下面沒有三角形，三角形面積均計入主成分），進而計算出準確的檢測結果。
      但需要注意的是，兩個雜質峰沒有*分離的話是不能采用谷-谷積分的，否則下面的三角形面積將被漏檢，這時應根據實際情況決定采用垂直積分或者切線積分的方式。

4、有關物質單個雜質的計算
      采用自身對照法比較簡單，直接用供試品溶液雜質峰面積除以對照溶液主峰面積，再除以對照溶液的稀釋倍數即可；而對于采用外標法或主成分對照品法時，需要分別計算對照品溶液的濃度和供試品溶液的理論濃度，其中供試品溶液理論濃度的應考慮供試品的含量，尤其對于不穩定的制劑產品。
      為便于申報數據的統計、穩定性和趨勢分析的要求，一般可以將有關物質計算的結果進行修約（用于放行檢驗的可以按照質量標準的小數點位數進行修約）：對于原輔料結果小于1的應保留至2位小數，對于結果大于1的應保留至1位小數1；對于制劑產品結果小于1的應保留至與報告閾值相同的小數點位數，結果大于1的應保留至1位小數2。
       將修約之后的結果與報告閾值進行比較，如果結果大于報告閾值，應報告實際修約結果；如果小于報告閾值，則可以報告“小于***（報告閾值/定量限的數值）"。對于一些特定雜質，峰面積小到未被積分時，可以報告“小于***（檢測限的數值）"/“未檢出（檢出限為***）"。

5、有關物質總雜質的計算

 有關物質總雜質不應該采用總峰面積，按照單個雜質的計算公式進行計算，因為這樣會將小于報告閾值的雜質也同時計算在內，造成結果的不準確?？傠s質在計算時，應將所有規定內的各超過報告閾值的雜質相加得出。

6、有關物質的統計

       有關物質在檢驗時，應盡可能地保證使用相同品牌、填料和規格的色譜柱，甚至相同品牌的儀器和試劑，以保證各雜質峰位置的一致性。在有關物質報告時，應同時報告各雜質的相對保留時間，一般相對保留時間2.0以內的雜質可以確定至小數點后一位，2.0以上的雜質會由于系統的漂移規定一定的范圍。在穩定性和年度質量回顧時對于有關物質的統計應基于相對保留時間分別對單一雜質和總雜質進行統計。