規(guī)格:20T/50T/100T，價格：400/700/1200元，產(chǎn)品簡介

Annexin是一類廣泛分布于真核細胞細胞漿內(nèi)鈣離子依賴的磷酯結(jié)合蛋白，參與細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Annexin V可選擇性結(jié)合磷***氨酸(phosphatidylserine，簡稱PS)。磷酯酰***酸主要分布在細胞膜內(nèi)側(cè)，即與細胞漿相鄰的一側(cè)。在細胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細胞都會把磷**氨酸外翻到細胞表面，即細胞膜外側(cè)。磷酯***酸暴露到細胞表面后會促進凝血和炎癥反應(yīng)。而Annexin V和外翻到細胞表面的磷酯**結(jié)合后可以阻斷磷酯**酸的促凝血和促炎癥反應(yīng)活性。因此Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。用帶有綠色熒光的熒光探針EGFP標記的Annexin V，即Annexin V-EGFP，就可以用流式細胞儀或熒光顯微鏡非常簡單而直接地檢測到磷酯**氨酸的外翻這一細胞凋亡的重要特征。與FITC的綠色熒光信號相比，EGFP的綠色熒光信號具有信號強，不易淬滅，穩(wěn)定性高等優(yōu)點。Annexin V-EGFP細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-EGFP Apoptosis Detection Kit)是用EGFP標記的重組人Annexin V來檢測細胞凋亡時出現(xiàn)在細胞膜表面的磷酯**氨酸的一種細胞凋亡檢測試劑盒。可以使用流式細胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測設(shè)備進行檢測。本試劑盒還提供了碘化丙啶染色液，碘化丙啶可以染色壞死細胞或凋亡晚期喪失細胞膜完整性的細胞，呈現(xiàn)紅色熒光。對于壞死細胞，由于細胞膜的完整性已經(jīng)喪失，Annexin V-EGFP可以進入到細胞漿內(nèi)，與位于細胞膜內(nèi)側(cè)的磷酯**酸結(jié)合，從而也使壞死細胞呈現(xiàn)綠色熒光。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區(qū)分開來。

試劑盒組份

試劑盒組份 20 assays  50 assays 100 assays儲存條件

Annexin V-EGFP 100μL 250μL 500μL 4℃避光

結(jié)合液 15 mL 40 mL 75mL 4℃

碘化丙啶 （PI） 100μL 250μL 500μL 4℃避光

試劑盒以外自備儀器和試劑

流式細胞儀或熒光顯微鏡、低速離心機、移液器,1.5m L離心管、載玻片、蓋玻片、PBS、不含EDTA的***

操作步驟

1、對于懸浮細胞：A、在進行完細胞凋亡刺激后，1000g (約1000-2000rpm) 離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)。（注意：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過程同時也起到了洗滌細胞的作用，可以保證后續(xù)Annexin V-EGFP的結(jié)合。）B、取1~5×105重懸的細胞，1000g離心5分鐘，棄上清，注意要把PBS吸干凈，（選做步驟：加入250ul的結(jié)合液輕輕重懸細胞，1000g離心5分鐘，棄上清）加入500µl 結(jié)合液輕輕重懸細胞。C、加入5µl Annexin V-EGFP，輕輕混勻；再加入5 μL 碘化丙啶，輕輕混勻。D、室溫(20-25℃)避光孵育10分鐘?？梢允褂娩X箔進行避光。E、隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-EGFP為綠色熒光，PI為紅色熒光。如果用于熒光顯微鏡下檢測，滴一滴上述染色后的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞即可檢測。2、對于貼壁細胞：A、把細胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細胞一次，用***(最好不用含有EDTA)消化細胞。（注：**消化時間不易過長，否則容易引起假陽性）B、細胞消化下來后，加入步驟2A中收集的細胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)。C、取1~5×105重懸的細胞，1000g離心5分鐘，棄上清，注意要把PBS吸干凈，（選做步驟：加入250ul的結(jié)合液輕輕重懸細胞，1000g離心5分鐘，棄上清）加入500µl結(jié)合液輕輕重懸細胞。D、加入5µl Annexin V-EGFP，輕輕混勻；再加入5 μL 碘化丙啶，輕輕混勻。E、室溫(20-25℃)避光孵育10分鐘。可以使用鋁箔進行避光。F、隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-EGFP為綠色熒光，PI為紅色熒光。如果用于熒光顯微鏡下檢測，滴一滴上述染色后的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞即可檢測。3、對于貼壁細胞的原位熒光顯微鏡檢測：注：本方法的優(yōu)點是可以原位觀察細胞凋亡，缺點是部分凋亡由于不貼壁而檢測不到。A、(選做)如果條件許可，把細胞培養(yǎng)于24孔板、48孔板或96孔板內(nèi)；或?qū)⒓毎谏w玻片上生長，用適當(dāng)?shù)牡蛲稣T導(dǎo)劑誘導(dǎo)細胞凋亡，并設(shè)立陰性對照組。B、吸除細胞培養(yǎng)液，加入PBS洗滌兩次；或?qū)⑸w玻片用PBS洗滌兩次。（選做步驟：用250ul的結(jié)合液洗滌蓋玻片一遍）C、在500μL 的結(jié)合液中加入5μL Annexin V-EGFP， 5 μL碘化丙啶，輕輕混勻。D、將上述溶液滴加于培養(yǎng)板孔中，或滴加于蓋玻片表面，使長有細胞的蓋玻片表面均勻覆蓋。E、室溫(20-25℃)避光孵育10分鐘; 隨即在熒光顯微鏡下觀察，Annexin V-EGFP為綠色熒光，PI為紅色熒光。

保存條件

4℃保存，Annexin V-EGFP和碘化丙啶染色液需避光保存，一年有效。為長期保存，可以把Annexin V-EGFP和碘化丙啶染色液適當(dāng)分裝后-20℃保存，Annexin V-EGFP結(jié)合液可以直接-20℃保存。

注意事項

1、如果有細菌或真菌污染，會嚴重影響檢測效果。2、染色后宜盡快檢測，時間過長可能會導(dǎo)致凋亡或壞死細胞的數(shù)量增加。同時熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，在進行熒光觀察時，盡量縮短觀察時間，同時在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。3、如果檢測時Annexin V-EGFP的熒光比較弱，建議用250ul的結(jié)合液輕輕重懸洗滌細胞，去除殘余的磷酸鹽溶液，同時也可縮小結(jié)合液的體積（比如200ul的體積）來提高Annexin V-EGFP的工作濃度。4、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。5、本試劑盒適用于檢測活細胞，流式細胞儀檢測時，細胞數(shù)量不以應(yīng)低于1×105，，不適用于檢測組織樣本。6、因檢測細胞的類型、凋亡誘導(dǎo)劑種類、使用的檢測儀器不同，因而流式檢測的熒光補償也不同，因此建議每次檢測均需使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的細胞作為對照，進行熒光補償?shù)恼{(diào)節(jié)。7、用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長Ex=488 nm; 發(fā)射波長Em=530 nm。Annexin V-EGFP的綠色熒光通過FITC通道（FL1）檢測；PI紅色熒光通過PI通道（FL2或FL3）檢測，建議使用FL3。熒光補償調(diào)節(jié)：使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細胞，作為對照進行熒光補償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。