背景:

spectrumlabs提供低蛋白結(jié)合的生物技術(shù)級纖維素酯(CE) 透析膜管和Float-A-Lyzer® G2即用型透析裝置，包括100-1,000,000道爾頓的9種截留分子量規(guī)格。膜截留分子量是指截留90%樣品時的膜孔徑大小，在蛋白純化應(yīng)用中，選擇zui適截留分子量的透析膜是去除不需要的小分子污染物所必須的。

由于在脫鹽、 pH值調(diào)整及緩沖液置換等應(yīng)用中，離子物質(zhì)通常小于膜孔徑，且至少比大分子物質(zhì)小1000倍，所以選擇截留分子量在3.5 kD至100kD 之間的膜即可在1-2天內(nèi)達到所需的分離效果。*需要考慮的是，所選的膜截留分子量應(yīng)小于需要截留的大分子物質(zhì)的分子量。

透析是對不穩(wěn)定的蛋白、敏感的酶以及精細化合物進行溫和分離的方法，以維持物質(zhì)的活性、功能以及穩(wěn)定的水相環(huán)境。但是，需要清除的小分子污染通常只比目標(biāo)蛋白小10-100倍，所以并不是所有截留分子量規(guī)格的膜都可以達到相同的分離效果。因此，在純化大分子物質(zhì)的應(yīng)用中，選擇*的膜截留分子量尤為重要。

目的:

比較使用截留分子量分別為20kD、50kD和100kD的Float-A-Lyzer® G2 即用型透析裝置（FAL-G2）透析24h后的相對分離效果，實驗處理目標(biāo)為截留抗體（IgG，166kD），并清除不需要的小分子物質(zhì)：分子量比抗體小100倍的維他命B12（Vit B12，1.35kD）以及分子量比抗體小10倍的細胞色素C（Cyt C，12.4kD）。

其次，為透析應(yīng)用建立通用的*截留分子量確定方法，如蛋白純化。

方法:

1. 3種不同分子量溶液制備如下：目標(biāo)蛋白（IgG-166kD：1 mg/ml 0.9% PBS），1/10分子量污染物（細胞色素C-12.4kD：0.2 mg/ml 0.9%PBS）和1/100分子量污染物（維他命B12-1.35kD：0.2mg/ml 0.9% PBS）。

2. 9個FAL-G2（5ml容量規(guī)格）每個上樣4ml溶液，具體設(shè)置如下：IgG分別上樣至20kD、50kD和100kD截留分子量膜管；Cyt C分別上樣至20kD、50kD和100kD截留分子量膜管；Vit B12分別上樣至20kD、50kD和100kD截留分子量膜管。

3. 9個FAL-G2均于室溫下在獨立的透析容器中透析24h，每個透析容器包括1L 的0.9% PBS緩沖液，并分別于3h和8h時置換新鮮緩沖液。

4. 在透析開始后0、3、8和24h，分別從每個 FAL-G2取出200μl 測試樣品，用0.9% PBS以1:4 稀釋，并用紫外可見分光光度計檢測稀釋后溶液濃度（IgG檢測波長為280nm，Cyt C檢測波長為406nm，Vit B12檢測波長為366nm）。

5. 計算36個測試樣品稀釋前濃度，與透析前原始濃度比較（0h 測試樣品），確定每種截留分子量FAL-G2（20kD、50kD和100kD）在3個時間點（3、8和24h）的溶質(zhì)截留百分比。

結(jié)論 :

IgG純化實驗總體的截留分子量效率為：100kD > 50kD > 20kD；100kD 為IgG純化的*截留分子量。

從不同截留分子量的截留曲線可以看到，50kD和100kD膜可在24h內(nèi)有效清除維他命B12（1/100分子量污染物）；而20kD 截留分子量大約需要36h。只有100kD截留分子量可有效清除細胞色素C（1/10分子量污染物），*清除需要2-3天。20kD和50kD截留分子量不能有效清除細胞色素C。