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◆ 標本收集
對于石蠟包埋的組織,活檢或手術切除標本應在2小時內取材或固定,避免組織自溶及抗原變性等影響免疫組化結果。對于冰凍切片的組織,取材后應立即放入液氮冷凍,然后放入-80℃保存。取材時應保持所檢標本原有的結構、形態,為避免擠壓組織,盡量使用鋒利刀片,并且避開壞死組織,除取病灶或含待檢抗原部位外,還應取病灶與正常交界處,即所取組織切片中同時應有抗原陽性和陰性區,以形成自身對照。
◆ 常用固定液
1.單純固定液
● 4%中性甲醛固定液:zui常用的固定液,能滿足常規HE及免疫組化、PCR等工作。一般無特殊要求的病理標本均適用。尤其值得注意的是,中性甲醛是以pH 7.2~7.4的磷酸緩沖液為溶劑配制的,其固定效果及對組織抗原性的保存均優于一般的4%甲醛固定液。此固定液配制后應密封并保存在陰涼處,保存時間不超過一個月。
--甲醛(40%) 100 ml
--無水磷酸氫二鈉 6.5 g
--磷酸二氫鈉 4.0g
--蒸餾水 900 ml
● 乙醇固定液:使用時以80%~95%的濃度為宜,具有硬化、固定、脫水等作用,對組織滲透力較弱,因此很少單獨使用,但其保存組織中的核酸強于中性甲醛,故常用于有核酸操作的實驗或檢查,如果用于證明尿酸結晶和保存糖原,可用100%乙醇固定組織。
● 4%的多聚甲醛:主要用于培養細胞的固定,動物灌注固定及后固定(動物器官經該液灌注后,然后取材,再用該液浸泡2~24小時)也常選該固定液固定。
2.混合固定液
● 乙醇一甲醛(乙醇-福爾馬林,AF)固定液:適用于皮下組織中肥大細胞的固定。該固定液有固定兼脫水作用,固定后的標本可直接入95%乙醇脫水。
--甲醛(40%) 100 ml
--95%乙醇 900 ml
● B5(醋酸鈉-升汞-甲醛)固定液:多用于固定淋巴組織。染色前應進行脫汞沉淀處理。
--無水醋酸鈉 1.25 g
--升汞 6.0 g
--蒸餾水 90 ml
--使用前加入甲醛 10 ml
● Bouin固定液:特別適用于睪丸活檢組織的固定。Bouin液對組織固定較均勻,收縮很少,不會使組織變硬變脆。需現配現用。
--飽和苦味酸水溶液(約1.22%) 75 ml
--甲醛 25 ml
--冰醋酸 5 ml
● Carnoy固定液:穿透能力強,可很好的固定細胞質和細胞核,特別適合于固定外膜致密的組織,亦適用于糖原及尼氏小體的固定。
--無水乙醇 60 ml
--氯仿 30 ml
--冰醋酸 10 ml
● Zenker固定液:經此液固定的標本,細胞核和細胞質染色頗為清晰,但成本較昂貴且需特殊處理汞。該固定液要避免接觸陽光,以免引起化學變化而失效。
--升汞 5.0 g
--重鉻酸鉀 2.5 g
--硫酸鈉 1.0g
--蒸餾水(加至) 100 ml
◆ 蠟塊制備
● 固定(對于石蠟包埋的組織,一般用4%的多聚甲醛固定液。對于冰凍組織,一般采用冰凍丙酮,但對于不同的組織和抗原,可選用不同的固定液,應根據具體情況而定);
● 脫水浸蠟(75%乙醇90~120min,85%乙醇90min,95%乙醇Ⅰ40min,95%乙醇Ⅱ40min,,無水乙醇Ⅰ30min,無水乙醇Ⅱ30min,二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各15min(可視觀察結果而定),石蠟Ⅰ60min,石蠟Ⅱ60min);
● 包埋(鐵板架包埋或其他容器,有時要求快速冷卻。)
◆ 石蠟切片
連續切片,切片厚2~4μm,按序貼在玻片的下1/3。52~60℃烤片18h。切片可在4℃保存數年(石蠟切片)。
◆ 冰凍切片
將術中送檢組織取材后,置于恒冷箱冰凍切片機切片架上,待組織塊冷凍變硬后切片,厚度為3~7μm。將切片貼附在載玻片上,空氣中稍風干(1~2min),后放入固定液中固定。
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