蛋白免疫印跡技術(shù) western-blot

免疫印跡技術(shù)服務(wù)/免疫印跡（immunoblotting）又稱蛋白質(zhì)印跡（western blot），它是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。western blot是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡（western blot）具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡（western blot）常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。

免疫印跡技術(shù)服務(wù)主要實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1. 蛋白質(zhì)抽提

實(shí)驗(yàn)對象為組織樣品，取適量（250~500mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品，加1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑），勻漿后抽提總蛋白（或核蛋白）。

實(shí)驗(yàn)對象為細(xì)胞樣品，每份樣品取1×106~1×107細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑）抽提總蛋白（或核蛋白）。

2. 蛋白質(zhì)定量：按BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。

3. 變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳（SDS-PAGE）：將準(zhǔn)備好的樣品液和預(yù)染蛋白marker分別上樣，標(biāo)準(zhǔn)加進(jìn)*個(gè)孔中，電泳分離蛋白。

4. 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，按Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移裝置說明組裝濾紙凝膠纖維素夾層，30mA恒流條件下，4°C轉(zhuǎn)移過一夜。

5. western blot膜的封閉和抗體孵育

膜在5%脫脂奶粉溶液中室溫孵育1小時(shí)以封閉膜上的非特異結(jié)合。

封閉過的膜加入一抗室溫孵育1.5小時(shí)，抗原抗體結(jié)合。

加入HRP標(biāo)記的二抗體以結(jié)合一抗，室溫孵育膜1小時(shí)。加入HRP標(biāo)記的GAPDH抗 體可同時(shí)檢測GAPDH含量。

6. western blot結(jié)果檢測：化學(xué)發(fā)光法檢測，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，經(jīng)X膠片曝光顯 影。圖片掃描保存為電腦文件，并用GIS1000分析軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值的數(shù)字化。

7. western blot數(shù)據(jù)分析：目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參GAPDH/Actin的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對含量。

8. 提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告，包括詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法及免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)數(shù)據(jù)。