人血栓調節蛋白（TM）分析檢測ELISA試劑盒使用說明書

    本試劑僅供研究使用

   目的：本試劑盒用于測定小鼠血清，血漿及相關液體樣本中轉化生長因子（TM）的含量。

    實驗原理：

    本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人血栓調節蛋白（TM）水平。用純化的轉化生長因子（TM）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入轉化生長因子（TM），再與HRP標記的羊抗鼠抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的轉化生長因子（TM）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人血栓調節蛋白（TM）濃度。

    試劑盒內容及其配制 ：

    試劑盒成份96孔配置48孔配置

    96/48人份酶標板1塊板（96T）半塊板（48T）

    塑料膜板蓋1塊半塊

    標準品：100ng/ml  1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）

    空白對照1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）

    標準品稀釋緩沖液1瓶（8.0ml）1瓶（4.0ml）

    生物素標記的抗OT抗體1瓶（8.0ml）1瓶（4.0ml）

    親和鏈酶素-HRP1瓶（12ml）1瓶（5ml）

    洗滌緩沖液1瓶（20ml）1瓶（10ml）

    底物A1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）

    底物B1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）

    終止液1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）

   血栓調節蛋白試劑盒 試劑盒組成：

    試劑盒組成48孔配置96孔配置保存

    說明書1份1份

    封板膜2片（48）2片（96）

    密封袋1個1個

    酶標包被板1×481×962-8℃保存

    標準品：45μmol/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存

    標準品稀釋液1.5ml×1瓶1.5ml×1瓶2-8℃保存

    酶標試劑3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

    樣品稀釋液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

    顯色劑A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

    顯色劑B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

    終止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

    濃縮洗滌液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存

    自備材料 ：

    1. 蒸餾水。

    2. 加樣器：5ul、10ul 、 50ul 、 100ul 、 200ul 、500ul、1000ul。

    3. 振蕩器及磁力攪拌器等。

    樣品收集、處理及保存方法 ：

    1、血清……操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

    2、 血漿……EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000 ×g離心30分鐘去除顆粒。

    3、 細胞上清液……1000 ×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

    4、 組織勻漿……將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000 ×g離心10分鐘，取上清液。

    5、 保存……如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70℃保存，避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

    血栓調節蛋白試劑盒操作注意事項：

    ●  試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。

    ●  實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。

    ●  不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。

    ●  使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

    ●  使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

    ●  底物A應揮發，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。

    ●  加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。

    ●  按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

    安全性 ：

    1.  避免直接接觸終止液和底物A、B，一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。

    2.  實難中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

    3.  不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

    試劑的準備 ：

    1.  標準品：標準品的系列稀釋應在實驗時準備，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：

    100

    ng/ml（6號標準品）原倍濃度不用稀釋直接加入50ul

    50

    ng/ml（5號標準品）100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液

    25

    ng/ml（4號標準品）100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液

    12.5

    ng/ml（3號標準品）100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液

    6.25

    ng/ml（2號標準品）100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液

    3.12

    ng/ml（1號標準品）100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液

    0

    ng/ml（空白對照）原倍濃度不用稀釋直接加入50ul

    2.  洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

    試劑盒性能 ：

    1.  靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。

    2.  特異性：不與其它細胞因子反應。

    3.  重復性：板內、板間變異系數均小于10%。

    人血栓調節蛋白ELISA檢測試劑盒 操作步驟：

    1.  使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產生加樣上的誤差。

    2.  根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用復孔的盡量做復孔。

    3.  加入稀釋好后的標準品50ul 于反應孔、加入待測樣品 50 ul 于反應孔內。立即加入 50 ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45分鐘。

    4.  甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。

    5.  每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。

    6.  甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。

    7.  每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鐘。避免光照。

    8.  取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結果。

    9.  在450nm波長處測定各孔的OD值。

    結果判斷與分析 ：

    1、 儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

    2、 以吸光度OD值為縱坐標（ Y ），相應的 OT 標準品濃度為橫坐標（ X ），做得相應的曲線，樣品的 OT 含量可根據其OD 值由標準曲線換算出相應的濃度，再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

    3、 檢測值范圍：0-100ng/ml

    4、 敏感度：0.39ng/ml