人胰島素樣生長因子結合蛋白-7(IGFBP-7)

試劑盒使用說明書

l  本試劑盒用于體外定量檢測人血清、血漿、組織、細胞上清及相關液體樣本中胰島素樣生長因子結合蛋白-7(IGFBP-7)的含量。

l  有效期：6個月

l  保存條件：2-8℃

使用目的

本試劑盒用于體外定量檢測人血清、血漿、組織、細胞上清及相關液體樣本中胰島素樣生長因子結合蛋白-7(IGFBP-7)的含量。

實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人胰島素樣生長因子結合蛋白-7(IGFBP-7)水平。用純化的人胰島素樣生長因子結合蛋白-7(IGFBP-7)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入胰島素樣生長因子結合蛋白-7(IGFBP-7)，再與HRP標記的胰島素樣生長因子結合蛋白-7(IGFBP-7)抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的胰島素樣生長因子結合蛋白-7(IGFBP-7)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人胰島素樣生長因子結合蛋白-7(IGFBP-7)濃度。

注意事項

• 本試劑盒僅用于科研，不得用于醫學診斷。
• 使用試劑盒前，請仔細閱讀說明書，以試劑盒內的說明書為準，請務必理解說明書內容。
• 酶標包被板屬于可拆型，開封后如未用完，板條應裝入鋁箔袋密封并2-8°C保存。
• 加樣樣本和試劑應盡快完成。
• 避免實驗過程中酶標板干燥；清洗后盡快加試劑。
• 實驗開始，所有試劑應平衡到室溫 (21-26°C) 后方可進行。溫度會影響吸光度值，但不影響樣本值。
• 切忌用口加樣，以免試劑和樣本粘到皮膚和粘膜上。
• 不要在處理樣本或試劑的區域抽煙、吃東西、喝酒或化妝。
• 操作時帶一次性手套，微生物的污染會影響實驗結果的正確性。
• 操作應按照國家規定的安全條列進行。
• 過期的試劑盒切勿再使用。
• TMB 底物對皮膚有刺激性，不慎入眼，立即用大量水沖洗，皮膚上不慎接觸到也應立即用肥皂，并用大量的水沖洗。試驗中被污染的物品在下次使用前應盡快清洗。

試劑盒組成

1.說明書                             1份

2.封板膜                             2張

3.酶標包被板                       12孔×8條

4.標準   800 ng/ml                0.6ml×1 瓶

5.標準品稀釋液                     2ml×1 瓶

6.生物素標記的抗IGFBP-7抗體       1.5ml×1瓶

7.顯色劑A液                        6ml×1瓶

8.顯色劑B液                        6ml×1瓶

9.終止液                           6ml×1瓶

10.酶標試劑                        6ml×1瓶

11. 30倍濃縮洗滌液                 20ml×1瓶

需要而未提供的試劑和器材

• 吸光度值在450nm波長下檢測的酶標儀。
• 1-2ml的加樣器。
• 100 ml和1L的量筒。

l  吸水紙。

l  37°C 恒溫箱。

l  蒸餾水或去離子水。

l  數據分析和繪圖軟件，圖紙。

l  標準和樣品稀釋的試管。

儲存條件

u  有效期內的試劑如開封后未用完，請2-8°C 保存。

u  過期的試劑請不要用，打開后的試劑2-8°C 保存。

u  酶標包被板必須2-8°C 保存，如有未用完的酶標包被板，打開的鋁箔袋須密封并2-8°C 保存。

u  開封后的試劑盒2-8°C只能保存8周。

試劑準備

試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡后方可使用。

樣本處理及要求

1.       血清-用采血管收集血液，室溫血液自然凝固30分鐘，1000 xg離心15分鐘左右，收集上清，盡早進行實驗，或者分裝后-20°C 或 -80°C 保存。

2.       血漿-收集好的血漿根據要求選擇EDTA或者檸檬酸鈉作為抗凝劑，2-8°C 1000 xg離心15分鐘左右，30分鐘內收集好，-20°C 或 -80°C 保存，避免反復凍融。

3.       細胞上清及相關液體-收集好的樣本離心后應盡快實驗，或者分裝后-20°C 或 -80°C 保存，避免反復凍融。

操作步驟

u  注意事項

• 所有試劑和樣本使用前必須在室溫下平衡，混勻試劑時不應起泡沫。
• 一旦實驗開始，各操作步驟都應盡快完成。
• 避免重復使用手中的吸頭和試管，以免交叉污染。
• 一般情況，酶的反應與時間和溫度成正比。

u  操作步驟

1. 標準品的稀釋：準備小試管6只，依次編好號碼，先在各小試管中加入標準品稀釋液100ul，然后取原濃度標準品100ul加入一只已編好號的試管中，充分混勻;再在該試管中取100ul加入第二支試管中，充分混勻；再在該試管中取100ul加入第三只試管中，充分混勻；再在該試管中取100ul加入第四只試管中，充分混勻；再在該試管中取100ul加入第五只試管中，充分混勻；然后在該試管中取100ul，棄掉。第六只試管作為0號標準品。稀釋后各管濃度分別是：400ng/ml,200ng/ml,100ng/ml,50ng/ml,25 ng/ml,0 ng/ml。

在酶標包被板上設標準品孔，依次加入不同濃度的標準品50ul（建議每個濃度做2個平行孔）。

1. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品、酶標試劑及生物素標記的抗IGFBP-7抗體，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品40μl，然后再加生物素標記的抗IGFBP-7抗體10μl。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
2. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
3. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。
4. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
5. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
6. 溫育：操作同3。
7. 洗滌：操作同5。
8. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
9. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
10. 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行

實驗結果計算

以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，即為樣品的實際濃度。