在同一組織細胞標本上需要同時檢測兩種抗原時，需進行雙重?zé)晒馊旧ｋp重免疫熒光標記法（double immunofluorescence labeling method）也分為直接法和間接法。

（1）直接法雙重免疫熒光標記：將標記有兩種不同熒光素的抗體（如抗A和抗B）以適當(dāng)比例混合，滴加在標本上孵育，然后洗去未結(jié)合的熒光抗體，在熒光顯微鏡下分別選擇兩種相應(yīng)的激發(fā)濾片觀察，即可對兩種抗原進行定位和定量。直接法簡便可靠，但靈敏度較低。

（2）間接法雙重免疫熒光標記：用未標記的兩種特異性*抗體孵育組織或細胞，洗去多余的*抗體后，再用兩種不同的熒光素分別標記的第二抗體孵育組織或細胞，洗去多余的第二抗體，后在熒光顯微鏡下分別選擇兩種相應(yīng)的激發(fā)濾片觀察，從而對兩種抗原進行定位和定量。使用此法應(yīng)注意兩種特異性*抗體必須來源于不同種屬，且熒光標記第二抗體的種屬必須與*抗體的種屬相匹配。

免疫熒光雙標技術(shù)中操作要點和注意事項

一、免疫熒光技術(shù)中標本制作的基本程序近似于酶免疫組化，不同點如下：

1、免疫熒光不需要使用雙氧水處理，封閉和一抗孵育與其相同。

2、免疫熒光的二抗使用不同熒光標記的二抗孵育，孵育時間根據(jù)抗體的工作濃度確定。

3、二抗孵育之后充分洗片后即可貼片、封片和觀察。

4、免疫熒光在封片時常使用封片劑或gan油：0.01M PBS （1：1）。條件許可，建議購買抗淬滅的封片液，使標本可以保存更久。

5、熒光抗體的孵育以及后續(xù)處理需要避光。

6、熒光抗體染色假陽性可能會多，需要分別設(shè)定陽性和陰性對照。

二、注意事項

1、熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h，時間過長，可能會使熒光提前衰退。

2、每次試驗均需設(shè)置以下三種對照：

（1） 陽性對照：陽性血清+熒光標記物;

（2） 陰性對照：陰性血清+熒光標記物;

（3） 熒光標記物對照：PBS+熒光標記物。

三、免疫熒光雙標的經(jīng)驗之談

1、選取一抗時，要求來源于兩種不同的動物，我用的是來源于家兔和大鼠的抗體，二抗則是不同熒光信號標記的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（綠）和donkey anti-rat-Tex-Red（紅）。

2、我的做法是兩種一抗同時孵育，然后兩種二抗同時孵育?？贵w濃度、孵育時間要自我摸索，我感覺一抗4℃孵育比較好，背景比較清晰。

3、我的陽性對照采用的是陽性組織切片，陰性對照則分別是家兔和大鼠的IgG，熒光標記物對照是PBS+熒光標記物。

4、封閉血清是二抗來源動物的正常血清，我用的是10%正常donkey血清。

5、其余事項同免疫熒光單標操作。

免疫組化雙重染色方法和步驟

在生物醫(yī)學(xué)和臨床研究實踐中，經(jīng)常需要檢測兩種不同物質(zhì)是否在同一樣品中共存或同一種細胞中共存，因此出現(xiàn)了免疫組織化學(xué)雙重染色。此方法有幾種類型，包括免疫酶組織化學(xué)和免疫熒光細胞化學(xué)法結(jié)合;同一切片的再度染色法（先對*種抗原染色，陽性部位拍照，再用酸處理使抗原抗體解離，繼之，對第二種抗原染色、拍照）;兩種酶標抗體3又重染色（分別用辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶標記第二抗體.用間接法分別顯示A和B抗原，如兩種一抗來自同一種屬，常有重疊染色）;不同種屬來源的抗體雙重染色。目前，zui常用的是zui后一種方法。

不同種屬來源的抗體雙重染色，兩種抗體間無交又反應(yīng).特異性較高，即使細胞內(nèi)抗原量很少也能檢測。但是，當(dāng)兩種抗原存在于同一部位而其中之一濃度較高，占優(yōu)勢時將妨礙另一種抗原染色，此種情況應(yīng)分別染色，首先染色含量較少的抗原，再顯示含量豐富的抗原。在該方法中應(yīng)用zui多的是把SABC法或SP法的實驗流程重復(fù)兩次，其中兩種不同特異性抗體（可以是小鼠或大鼠單克隆抗體和兔多克隆抗體的任何兩個組合），與一抗對應(yīng)的不同種屬生物素化二抗和兩種不同顯色系統(tǒng)。即可將不同部位或相同部位的兩種抗原顯示出來。該方法用于石蠟切片時應(yīng)考慮所選擇的兩個抗體的修復(fù)方法應(yīng)該一致或一個抗體的修復(fù)對另一個抗體的染色結(jié)果沒有影響。

SP法雙重染色步驟

1～6步驟與SABC法相同，但無需使用生物素阻斷劑：

7.切片加入A特異性抗體（如兔抗A抗體），4=C孵育后，PBS沖洗3次，每次5分鐘

8.滴加生物素化二抗（如抗兔二抗），室溫孵育切片10分鐘，繼而PBS沖洗3次，每次5分鐘;

9.滴加鏈霉菌抗生物素蛋白—堿性磷酸酶，室溫孵育10分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘

10.堿性磷酸酶顯色液（BCIP/NBT）顯色（紫藍色）.PBS沖洗3次，每次5分鐘;

11.滴加0.05%鹽酸，室溫10分鐘（可避免已顯色的抗原褪色）;

12.滴加抗小鼠二抗同種屬的非免疫血清，37~C孵育10分鐘;

13.滴加B特異性抗體（如小鼠抗B抗體），4~C孵育。PBS沖洗3次，每次5分鐘;

14.滴加生物素化抗小鼠二抗，室溫孵育切片10分鐘。PBS沖洗3次，每次5分鐘：

15.滴加鏈霉菌抗生物素蛋白—過氧化物酶，室溫孵育10分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘

16.過氧化物酶顯色液（AEC）顯色（鮮紅色）.PBS沖洗3次，每次5分鐘

17.蘇木精復(fù)染細胞核;

18.水溶性封片劑封片。

在使用SP法雙重染色之前需要對待測抗原的性質(zhì)、二抗的種屬類型和顯色系統(tǒng)進行詳細設(shè)計。購買免疫組化雙染試劑盒時;應(yīng)選擇與設(shè)計方案相同的配套試劑。在選擇一抗時應(yīng)避免定位在細胞的同一部位（如胞核、胞漿和胞膜）的兩種抗原，如果不可避免，選擇免疫熒光組織細胞化學(xué)雙重染色方法，因為兩種不同顏色的熒光重疊后呈現(xiàn)另一種顏色的熒光（如紅色熒光與綠色熒光重疊呈現(xiàn)黃色熒光），它比SP法的顯色系統(tǒng)更容易區(qū)別和辨認陽性結(jié)果。

在進行雙重染色之前，必須對所選擇的一抗分別進行單獨染色預(yù)實驗，預(yù)實驗條件必須與雙染條件相同，在觀察預(yù)實驗結(jié)果和抗體定位正確后，再進行雙染實驗。