作者：張坤博士

徠卡顯微系統 生命科學部 應用專員

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如何免除活細胞標記中的清洗（washout）步驟？

SNAP-tag等標記方法為活細胞顯微成像帶來了革命性的變化，也因此被Nature雜志評為2004年zui熱門的科研技術之一。但是傳統的SNAP-tag標記仍然有很大的缺陷。將帶有熒光探針的底物BG加入細胞后需要多次清洗細胞，才能將未結合的BG去除從而消除背景熒光對成像的影響。即不能實時在底物與SNAP-tag結合的過程中，跟蹤SNAP-tag融合蛋白的動態變化。YasuteruU等科學家基于SNAP-tag研發了一種熒光偶聯性激活標記方法（fluorescenceactivation-coupled protein labeling, FAPL），通過改造SNAP-tag的底物來解決這一問題，從而能夠實時的記錄細胞內一些動態的生命過程，如蛋白表達、定位、轉運及降解等過程[13-15]。在Snap-tag底物BG鳥嘌呤的C-8位置引入一個淬滅基團，可以有效的通過熒光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)或光誘導電子轉移（Photoinduced electron transfer，PET）吸收BG上標記的熒光基團熒光能量，使其在與SNAP-tag結合之前是不會發出熒光的。一旦底物與SNAP-tag結合，該淬滅基團就會解離下來，熒光基團將發出熒光（圖4）。因此熒光信號只有在SNAP-tag融合蛋白上才會被點燃，所以也就不再需要任何的清洗步驟。Utrano及其同事已經成功的將這種標記方法應用于研究細胞運動中表皮生長因子受體（EGFR）相關的膜運輸過程（圖5）[13]。

圖3.HEK293活細胞中ATTO647N和Chromeo494分別標記的EGF和EGFR的STED超高分辨率成像。由圖E、F、K、L可以看出，STED對EGFR-EGR復合體的成像分辨率比共聚焦提高了3~4倍。圖片來自Two-color STED microscopy in living cells，Patrina A. P et al, Biomedical Optical Express，2011

圖4. 傳統的SNAP-tag標記方法與基于FAPL的SNAP-tag標記方法比較。圖片來自于Live-cellreporters for fluorescence imaging,Ivan R,CurrentOpinion in Chemical Biology , 2014, 20:36 –45

圖5.EGFR在細胞中轉運的實時記錄。（a）示意圖，用于解釋如何利用FAPL探針來實時追蹤EGFR相關的細胞膜轉運過程。（b）COS7細胞中表達的EGFR用DRBG-488標記（綠色），溶酶體用lysosometracker（紅色）標記。（c）對表達SNAP-EGFR–CFP的MDCK細胞進行共聚焦實時成像。SNAP-EGFR-CFP用DRBG-488進行標記。在5min時加入了EGF刺激細胞，每個1min拍攝一次熒光圖像。相對于CFP的成像，DRBG-488能夠更清楚的記錄EGF刺激之后囊泡的形成及其在溶酶體里的聚集。圖片來自Real-TimeMeasurements of Protein Dynamics Using Fluorescence Activation-Coupled Protein Labeling Method,Toru K et al, J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 6745–6751

為了能夠消除自發熒光，更清楚的對更深的組織甚至是活體動物進行熒光成像，科學家們對近紅外染料的研發從未止步過[16]。Johnsson等科學家zui近基于sillion-rhodamine熒光基團，推出了一款新的細胞膜通透性的近紅外染料（SiR）[17]。在未與SNAP-tag等標簽結合之前，成聚集狀或者與疏水結構非特異性結合的SiR會處于不發熒光的螺甾內酯狀態；一旦與標簽蛋白結合，SiR將處于兩性離子狀態，而發出很強的熒光（圖6）。將SNAP-tag的底物標記SiR便形成了SiR-SNAP。因此，利用SiR-SNAP對活細胞進行標記時，背景熒光非常低，從而免除了清洗步驟，實現實時的熒光探測。同時由于其光譜的近紅外特性，可以應用于深層組織，如大腦切片的成像（圖7）。

圖6. （A）SiR的兩種形式。（B）SiR的激發光譜（藍色虛線）和發射光譜（紅色實線）。

圖7. SiR-SNAP標記的大鼠腦片。a,子宮內原位電轉示意圖。紅色方框內的區域即為b圖中進行熒光成像的區域。b,通過子宮內原位電轉將SNAP和GFP的質粒以1:1的比例導入到E16期的神經元前體細胞中。對E19期的大鼠腦組織進行了切片并用SiR-SNAP和Hoechst進行了染色。c,對b圖中黃色方框區域的放大，GFP和SiR-SNAP的良好共定位驗證了SiR-SNAP標記的特異性。圖片來自Anear-infrared fluorophore for live-cell superresolution microscopy of cellularproteins, Kai Jet al, Nature Chemistry, 2013

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SiR在STED超高分辨率顯微成像中的應用

Johnsson及其同事也將SiR-SNAP應用到STED超高分辨率顯微鏡對中心體蛋白Cep41的活細胞成像中[17]（圖8）。共聚焦圖像顯示SiR-SNAP標記的U2OS細胞中的Cep41-SNAP在微管及中心體中均有定位（圖8b）。STED超高分辨率顯微鏡發現SNAP-Cep41以環形排列在中心體上，該環形的直徑為175±13nm （n=7），這說明Cep41定位于微管形成的中心粒壁上（圖8d）。Z軸方向成像顯示由SNAP-Cep41形成的結構大約長440±28nm （n=16），這與已經報道的中心粒的長度是一致的，這說明Cep41形成的環形結構貫穿于整個中心粒。

圖8. U2OS活細胞中Cep41的共聚焦及STED成像。a, 中心體結構示意圖。b,SiR-SNAP標記的Cep41和Hoechest 33342標記的細胞核的雙色共聚焦圖像。c,結合于微管的Cep41的共聚焦及STED熒光圖像。d,位于中心體的Cep41的共聚焦及STED熒光圖像。標尺，500nm。圖片來自Anear-infrared fluorophore for live-cell super resolution microscopy of cellularproteins, Kai Jet al, Nature Chemistry, 2013

細胞骨架如微管、微絲等一直是生命科學研究的重點。近期Johnsson等科學家將SiR直接標記于與微管和微絲分別特異性結合的小分子docetaxel和jasplakinolide，即形成SiR-tubulin和SiR-actin，實現了在不對細胞或組織進行任何轉染或基因組修飾的條件下直接進行活細胞成像[18]（圖9）。SiR-tubulin和SiR-actin仍然保留了SiR的優良特性，非常適用于STED成像（圖10）。SiR-tubulin標記人成纖維活細胞中的微管后, STED超高分辨率顯微鏡揭示了細胞質中及中心體上tubulin的定位及結構信息。在這種標記和成像方法下，細胞質中微管的粗細測量為39±10 nm, 這是目前活細胞中微管成像的zui高分辨率。STED成像也清晰的揭示了中心體上的微管以9個亞復合體排布成直徑約176±10 nm的環形（圖10a，b），兩個臨近亞復合體之間的夾角成39°±13°（圖10c），這些數據與之前用電子顯微鏡研究得到的數據是一致的[19]。SiR-actin標記活的大鼠海馬區原代神經元后，STED超高分辨率顯微鏡揭示了微絲在軸突上以181±20 nm的區間成周期性排布（圖10d-f），這與之前用固定的樣品得到的結果是一致的[20]。這些數據充分說明了SiR-actin和SiR-tubulin在活細胞超高分辨率顯微鏡成像中使用的便捷性及可靠性。目前SiR-tubulin和SiR-actin已經被Spipochrome公司商品化，使用方法也有非常詳細的描述。

圖9. SiR-tubulin和SiR-actin。a, SiR-tubulin和SiR-actin的分子結構。b，SiR-tubulin和SiR-actin只有在分別結合了微管或微絲后才能發出熒光。c，SiR-tubulin和SiR-actin標記的人成纖維細胞，結構照明成像，標尺，5 mm。圖片來自Fluorogenic probes forlive-cell imaging ofthecytoskeleton, Kai J et al, NatureMethods, 2014

圖10. SiR-tubulin和SiR-actin標記的活細胞的STED成像。（a）人成纖維活細胞中心體上微管的STED代表性圖像(已經過Richardson-lucy反卷積運算)。（b）人和小鼠的中心粒的直徑。（c）人和小鼠中心粒中臨近的兩個微管亞復合體之間夾角。（d）16天的大鼠海馬區元代神經元在用SiR-actin染色后的STED原始圖像。（e-f）微絲在神經元軸突上以間隔為181±20 nm的距離成周期性分布。圖片來自Fuorogenic probes forlive-cell imaging ofthecytoskeleton, Kai J et al, NatureMethods, 2014

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“ 總 結 ”

新的熒光探針和成像技術的發展，極大地加快了生命科學探索的步伐，并將繼續為細胞生命活動提供極其重要的新見解。近十年中，超高分辨率和單分子顯微鏡發展迅速并越來越成熟化，可以預見在不就的將來利用超高分辨率顯微鏡對活細胞進行成像將成為非常常規的科研手段。作為在這個方向邁出的一步，各種各樣的新型活細胞標記方法和熒光探針的研發也得到了越來越多的科學家的青睞和重視。總體來說，SNAP-tag等標簽標記方法已經在活細胞系統的研究和操控中顯示出極大的潛力。而SiR等新型染料的研發必將進一步推進超高分辨率顯微鏡在活細胞成像中的應用。