(一)酶標(biāo)抗體的條件

1.純度高、含雜蛋白少,用IgG優(yōu)于血清抗體，用Fab優(yōu)于IgG。

2.特異性強(qiáng) 即抗IgG與IgG在免疫電泳上只有一條沉淀線,與IgG的全血清也只有一條沉淀線,這才算是特異性的單價(jià)抗體。

3.效價(jià)高 一般瓊脂擴(kuò)散鑒定為1︰64以上才算合格。

(二)酶標(biāo)記方法

1.交聯(lián)法 交聯(lián)法通常用的交聯(lián)劑是戊二醛，戊二醛商品大多為25%的水溶液，利用戊二醛分子上對(duì)稱的兩個(gè)醛基，分別與酶和蛋白質(zhì)分子中游離的氨基、酚基等以共價(jià)鍵結(jié)合而進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記時(shí)應(yīng)盡量采用新鮮純品，當(dāng)戌二醛的OD235nm/OD280nm<3時(shí)，即為好的交聯(lián)劑。

戊二醛交聯(lián)法又分為一步法和二步法。

(1) 一步法：即把酶、戊二醛和抗體一起加入進(jìn)行交聯(lián)。然后透析出過量的戊二醛而制備出具有高分子量的酶結(jié)合物。由于抗體分子量大(16萬(wàn))，酶分子量小(4萬(wàn)),抗體分子的氨基數(shù)比酶蛋白分子氨基數(shù)多得多，結(jié)果生成的抗體-戊二醛或抗體-戊二醛-抗體多而造成酶標(biāo)物的活性小。一步法操作：①抗IgG-AKP的制備：將10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中，在冰浴中緩緩攪拌，盡量避免氣泡產(chǎn)生，*溶解后，緩緩滴加1%戊二醛溶液4ml，使戊二醛的zui終濃度為0.2%，移至室溫中靜置2h~3h后，以0.01Mol/L pH7.0 PBS液4℃充分透析或以SephadexG25柱除去過量的戊二醛，4℃保存?zhèn)溆?也可保存于50%甘油中置低溫冰箱);②抗IgG-HRP的制備：將12mgHRP溶于含5mg抗IgG的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中,緩慢攪拌下加入1%戊二醛溶液4mL，置室溫2h~3h，充分透析或以SephadexG25除戊二醛，小量分裝后保存于低溫冰箱，避免反復(fù)凍融。或冷凍干燥保存。

(2) 二步法：是先使酶與戊二醛反應(yīng),除去未反應(yīng)的戊二醛，再使已“活化”的酶分子與抗體分子的氨基結(jié)合，zui后加入少量的賴氨酸封閉被戊二醛激活的酶的殘基。二步法操作：將10mg的酶溶于0.2ml含1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS中室溫放置18h，充分透析或以SephadexG25柱除去未反應(yīng)的戊二醛。加生理鹽水至1ml然后加入1ml(含5mg)的抗體溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液，混合后4℃冰箱放置24h，加入0.1ml 0.2mol/L賴氨酸，置室溫2h，以0.15Mol/L pH7.2 PBS液充分透析，離心去沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，再進(jìn)一步以硫酸銨沉淀純化后應(yīng)用。AKP一般不采用二步法,而只用一步法。

改良HRP二步標(biāo)記法：取HRP10mg溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液中，加入25%戊二醛0.1ml，37℃溫育2h后加入冰冷的分析純的無水乙醇2ml，2 500r/min離心沉淀10min~15min，傾去溶液。沉淀以80%乙醇4ml~5ml混懸，同上離心，傾去乙醇，將管倒置，使乙醇充分流出。沉淀用1ml 0.05Mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液溶解，加入0.5ml~1ml 抗IgG抗體溶液(含抗體15mg左右)，放在冰箱內(nèi)后，加KH2 PO4，使近中性即可應(yīng)用。

2.氧化法 采用過碘酸鈉，過碘酸鈉是強(qiáng)氧化劑，能將HRP的甘露糖部分(與酶活性無關(guān)的部分)的羥基氧化成醛基，然后與抗體的氨基結(jié)合,形成酶標(biāo)抗體。

(1)氧化法操作過程如下：將5mgHRP溶于新配制的1ml 0.30Mol/LpH8.1重碳酸鈉中，加0.1 ml 1%氟二硝基苯(FDNB)無水乙醇溶液,在室溫中混合后，再加入1ml 0.04Mol/L~0.08Mol/L過碘酸鈉(NaIO4)，置室溫中輕攪30min，在溶液呈黃綠色時(shí)，加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液，在室溫中放置1h，使氧化反應(yīng)中止，然后在4℃中對(duì)0.10Mol/L pH 9.5重碳酸鈉緩沖液透析，換液3次。在3ml HRP-醛基溶液中，加入5mg(溶于1ml的碳酸鹽緩沖液中)，室溫置2h~3h，加入5mg氫化硼鈉(NaBH4)，于4℃冰箱放置3h或，然后用PBS液充分透析，離心去沉淀物。上清液即為酶結(jié)合物，純化后使用。

(2)改良過碘酸鈉法：①取5mg HRP溶于0.5ml雙餾水中，加入新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml雙餾水+128mg NaIO4) 0.5ml，混勻，置4℃30min;② 取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O+0.09ml乙二醇)0.5ml，室溫放置30min;③加入含5mg純化抗體的水溶液1ml，混勻，并裝入透析袋，對(duì)0.05Mol/L pH 9.5碳酸鹽緩沖液緩緩攪拌透析6h(或)，使之結(jié)合;④加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml，混勻，置4℃2h;⑤在以上溶液中緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液，混勻，4℃30min，離心，去上清，沉淀以少許0.02Mol/L pH7.4 PBS液溶解，裝入透析袋，以同樣液體在4℃透析除鹽;⑥次日取出離心，以除去不溶物，即得酶-抗體(HRP-IgG)結(jié)合物，以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml;⑦效價(jià)測(cè)定合格后，加入等量甘油，分裝小瓶，低溫保存。