近紅外光譜法在藥物分析中的應用

馮艷春 胡昌勤（中國藥品生物制品檢定所 北京 100050）

    近紅外（Near Infrared，NIR）光譜的波長范圍是780~2526nm（12820~3959cm^-1），通常又將此波長范圍劃分為近紅外短波區（780~1100nm）和近紅外長波區（1100~2526nm）。由于該區域主要是O-H，N-H，C-H，S-H等含氫基團振動光譜的倍頻及合頻吸收，譜帶寬，重疊較嚴重，而且吸收信號弱，信息解析復雜，所以雖然該譜區發現較早，但分析價值一直未能得到足夠的重視。近年來，由于巨型計算機與化學統計學軟件的發展，特別是化學計量學的深入研究和廣泛應用，使其成為發展zui快、zui引人注目的光譜技術^[1]。而且由于該技術方便快速，無需對樣品進行預處理，適用于在線分析等特點，在藥物分析領域中正不斷得到重視與應用。

1近紅外光譜的測量

根據NIR光譜的獲得方式，通常有透射(Transmittance)和漫反射(Diffuse

Reflectance)兩種^[2]。

透射測定法的定量關系遵從Lambert-Beer定律，主要適用于液體樣品，其正常的工作波長范圍是850~1050nm^[3]。浙江大學的史月華等人用該原理，在93%~97.4%的濃度范圍內利用維生素E在6061~5246cm^-1處的近紅外吸收峰面積積分值和其濃度關系建立回歸方程，對已知濃度的樣品進行預測，誤差及相對誤差均在0.79%~0.9%內^[4，5]。

漫反射測定法是對固體樣品進行近紅外測定常用的方法。當光源垂直于樣品的表面，有一部分漫反射光會向各個方向散射，將檢測器放在與垂直光成45^o角的位置測定散射光強的方法稱為漫反射法。漫反射光強度A與反射率R的關系為

式中，R₁為反射光強，R₀為*不吸收的表面反射光強。國內已有人先后用漫反射技術測定了精氨酸阿司匹林^[6] 、安乃近^[7] 、蘆丁和維生素E^[8] 等的含量，并且用反射光譜法對磺胺噻唑^[9]進行質量評價。

    以透射和漫反射為測試基礎，為適應不同物質在不同狀態時直接測定其近紅外光譜，90年代以來光纖技術在NIR中得到了廣泛應用。光纖不僅可方便的傳輸光譜信號，各式各樣的光纖探頭還極大地方便了NIR進行各類快速在線分析。

2近紅外光譜技術在藥物分析中的應用

2.1應用范圍

近紅外光譜法在藥物分析領域中的應用范圍相當廣泛，它不僅適用于藥物的多種不同狀態如原料^[10]、完整的片劑、膠囊與液體等制劑^[11]，還可用于不同類型的藥品，如蛋白質^[12]、中草藥^[13]、抗生素^[14] 等藥物的分析。NIR更適用于對原料藥純度、包裝材料等的分析與檢測以及生產工藝的監控^[15，16] ；利用不同的光纖探頭可實現生產工藝的在線連續分析監控^{[17，18，19，20，21]}  。

2.2定性、定量分析

現代近紅外光譜技術不是通過觀察供試品譜圖特征或測量供試品譜圖參數直接進行定性或定量分析，而是首先通過測定樣品校正集的光譜、組成或性質數據（組成或性質數據需通過其它認可的標準方法測定），采用合適的化學計量學方法建立校正模型，再通過建立的校正模型與未知樣品進行比較，實現定性或定量分析。

2.2.1定性分析

近紅外光譜譜帶較寬，特征性不強，因此很少像其它光譜（如紫外光譜和紅外光譜）那樣用于化合物基團的識別及結構的鑒定。近紅外光譜的定性分析一般是用于確定分析樣品在已知樣品集中的位置^[22]。常用的方法包括:

（1）判別分析法：判別分析是經典的定性識別方法，其基本思路是相同樣品在不同波長下具有相近的光譜吸收，這種光譜間的比較可以是原始光譜，也可以是經過處理的光譜。

（2）主成分分析（Principal Component Analysis  PCA）法：利用PCA方法將多波長下的光譜數據壓縮到有限的幾個因子空間內，再通過樣品在各因子空間的得分確定其歸屬類別，但PCA對樣本與校正集間的確切位置缺乏定量的解釋。任玉林等采用此方法研究了去痛片^[23]的近紅外漫反射光譜，總結出對標化后的數據進行主成分分析可減小顆粒大小的變化所產生的散射影響，并且用第二主成分得分對*主成分作圖可以將合格樣品與不合格樣品區分開來。其缺點是當真藥與劣藥的含量相當接近時此法容易分錯^[24]。

（3）馬氏距離（Mahalanobis Distance  MD）法：該方法的核心是通過多波長下的光譜距離定量描述出測量樣本離校正集樣本的位置，因而在光譜匹配異常點檢測和模型外推方面都很有用。但應用該方法時，波長位置的選擇非常重要，波長點過少，光譜得不到合理的描述；波長點過多，計算量大，為此，徐廣通提出將PCA與馬氏距離相結合解決模型的適用性判斷，可以充分利用PCA對大量光譜數據進行降維處理，也較好地解決了馬氏距離計算時波長點的選擇問題，避免了大量光譜數據直接進行馬氏距離計算出現的共線性或計算量大等問題，且克服了采用PCA自身進行判斷界限不易量化的問題^[25]。

2.2.2定量分析

近紅外光譜測量時一般不需對樣品進行預處理，但測定的光譜可能受到各種干擾因素的影響。利用單一波長下獲得的光譜數據很難獲得準確的定量分析結果。NIR光譜結構復雜，譜圖重疊較多，所以在進行定量分析時，一般采用多波長下獲得的數據并進行一定的數據處理才能獲得準確可靠的分析結果。常用方法如下：

（1）主成分回歸（Principal Component Regression， PCR）：原理與PCA相同。吉林大學的任玉林等在此方面進行了深入研究^[26]。PCR在解釋光譜數據時起著重要作用，從主成分權重圖中能夠確定主成分與哪個組份有關，但確切而全面地解釋每個主成分代表什么迄今仍是zui難解決的問題。

（2）偏zui小二乘法（Partial Least Square PLS）：該法是一種全光譜分析方法，充分利用多個波長下的有用信息，無需刻意的選擇波長，并能濾去原始數據噪音，提高信噪比，解決交互影響的非線性問題，很合適在NIR中使用^[27]。實驗證明，PLS法同近紅外漫反射光譜法結合，直接分析固態粉末藥品磺胺甲基異唑^[28]、安體舒通^[29]、安乃近^[30]、磺胺脒^[31]是可行的，同其它方法相比具有速度快、簡便、且不破壞樣品的優點。

（3）人工神經網絡法（Artificial Neural Networks  ANN）：近年來興起的ANN法研究，根據樣品各組分的光譜數據建立人工神經網絡模型，預測未知樣品并討論影響網絡的各參數。采用ANN法對阿司匹林^[32]、撲熱息痛^[33]、美的康^[34]等藥物定量分析的結果表明，ANN法的zui大優點是其抗干擾、抗噪音及強大的非線性轉換能力，對于某些特殊情況ANN會得到更小的校正誤差和預測誤差，并且它的預示結果要稍優于PLS（t檢驗無顯著差異）。這可能是由于ANN法具有更強的非線性處理能力所致。

此外還有多元線性回歸（Multiple Linear Regression  MLR）、拓撲（Topology TP）等方法也在近紅外光譜分析中得到應用。

3問題與展望

盡管N I R在藥物分析領域顯現出勃勃生機，但目前它還存在一定的弱點。首先，它是一種間接的相對分析技術，通過收集大量具有代表性的標準樣品，通過嚴格細致的化學分析測出必要的數據，再通過計算機建立數學模型，預測未知樣品的結果。而模型的建立需耗用大量的人力、物力和財力；其次，由于NIR譜區為分子倍頻與合頻的振動光譜，信號弱，譜峰重疊嚴重，所以目前還僅能用于常量分析，被測定組分的量一般應大于樣品重量的0.1%；此外，在進行近紅外光譜分析時，應考慮樣品的特征、分析實驗的設計及數據處理等多方面的問題，才能取得正確的分析結果，建立可靠的校正模型是近紅外光譜成功的關鍵，而合理的實驗設計和恰當的分析模型則是建立校正模型的關鍵^[35]。

NIR光譜分析的zui大特點是操作簡便、快速，可不破壞樣品進行原位、在線測量；測量信號又可以遠距離傳輸和分析；特別是與計算機技術和光導纖維技術相結合，采用NIR透射、散射、漫反射光譜學檢測方法，可以不使用化學試劑，不必進行預處理，可直接對顆粒狀、固體狀、糊狀、不透明的樣品進行分析。這些特點正逐漸被制藥界所認識，并顯示出極大潛力，在制藥工作和質量控制分析中具有廣闊的應用前景。此外，NIR用于生產過程中的含量與水分分析也表現出*的魅力^[36]。目前NIR已成為AOAC(Association of Official Analytical Chemists)一種標準分析方法應用于藥品檢測中^[37]。儀器生產商和藥物分析專家的合作開發已使FDA、歐洲和加拿大藥物管理局正式研究用近紅外光譜分析技術取代繁瑣費時的常規分析方法的可行性，部分測試項目已被FDA批準為標準方法。USP(United States Pharmacopia第25版)zui近已在附錄中增補近紅外分析方法^[38]。

國內，在SDA（State Drug Administration）的支持下，我所正在探索藥品監督檢驗執法過程中采用NIR進行快速鑒別及定量分析的可行性。結合全國抽驗工作， 對NIR模型的準確性及模型傳遞的誤差進行系統評價，這項工作的開展對打擊假劣藥品具有重要意義。

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