熒光標記二抗的選擇-FITC/Rhodamine/Texas Red/Cy/PE/AMCA

一般來講，耦聯到二抗上的探針主要有酶（辣根過氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），熒光基團（FITC, RRX, TR, PE, Rhodamine）和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實驗。對于Western Blot和ELISA，zui常用的二抗是酶標二抗；而細胞或組織標記實驗（細胞免疫化學，組織免疫化學，流式細胞術）中通常使用熒光標記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測信號，可以使用Biotin/Avidin檢測系統。其中熒光素是具有光致熒光特性的染料，熒光染料種類很多，目前常用于熒光標記二抗有以下幾種：

【異硫氰酸熒光素-Fluorescein Isothiocyanate （FITC）熒光標記二抗】

FITC純品為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。FITC分子量為389.4，zui大吸收光波長為490～495nm，zui大發射光波長為520～530nm，呈現明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年，是目前應用zui廣泛的熒光素。由于FITC是小分子化合物，每一個抗體可標記幾個FITC分子，IgM通常用小分子的熒光素標記，如FITC、Cy3/5、Texas Red等。FITC熒光二抗主要優點是人眼對黃綠色較為敏感，通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。然而FITC的zui大缺點是淬滅快，因此要和抗淬滅劑一起使用。

【四甲基異硫氰酸羅丹明-Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate（TRITC），Rhodamine Red-X（RRX）, Texas Red（TR）熒光標記二抗】

這些羅丹明的衍生物耦聯基團具有不同的吸收波長 （550, 570, 596nm）和zui大發射波長（570, 590, 620nm）。盡管TRITC經常和FITC一起在雙標記實驗中使用，使用RRX和TR可以得到更好的顏色區分。在使用裝有氪氬燈的激光共聚焦掃描顯微鏡作三標記的實驗時，RRX尤其有用，可以和Cy2（或者FITC）和Cy5一起使用，因為RRX的發射波長在Cy2和Cy5中間，而且和這兩者覆蓋都很少。氪氬燈激發光為488nm，598nm和647nm，分別是Cy2（FITC）, RRX和Cy5的理想激發波長。因為FITC和PE可以被氬燈的488nm波長激發, 在流式細胞儀中用FITC作雙標，另一種用藻紅蛋白（PE）耦聯基團要比羅丹明好。TRITC為羅丹明的衍生物，呈紫紅色粉末，較穩定。zui大吸收光波長為 550nm，zui大發射光波長為620nm，呈現橙紅色熒光，與FITC的綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或對比染色。因其熒光淬滅慢，也可用于單獨標記染色。

【菁類染料-Cyanine dyes（Cy2, Cy3, Cy5）】

Cy2耦聯基團激發波長為492nm，發光為波長510nm的綠色可見光。Cy2和FITC使用相同的濾波片。由于Cy2比FITC在光下更穩定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片劑，因為這種抗淬滅劑和Cy2反應，在染色片儲存后會導致熒光微弱和擴散。Cy3和Cy5比其他的熒光團探針要更亮，更穩定，背景更弱。Cy3耦聯基團激發光的zui大波長為550nm，zui強發射光為570nm。因為激發光和發射光波長很接近TRITC, 在熒光顯微鏡中，可使用和TRITC一樣的濾波片。

Cy3在氬光燈（514nm或528nm）下可以被激發出50％的光強，在氦氖燈（543nm）或者汞燈（546nm）下則約75％。Cy3可以和熒光素一起作雙標。Cy3還可以和Cy5一起在共聚焦顯微鏡實驗中作多標記。Cy5耦聯基團的激發波長zui大650nm，發光波長zui大670nm。在氪氬燈（647nm）下它們可被激發出98％的熒光，在氦氖燈下（633nm）為63％。Cy5可以和很多其他的熒光基團一起用在多標記的實驗中。由于它的zui大發射波長在670nm，Cy5很難用裸眼觀察，而且不能用汞燈作理想的激發。通常觀察Cy5時采用具有合適激發光和遠紅外檢測器的共聚焦顯微鏡。在水相封片劑中應當加入抗淬滅劑。使用傳統的表面熒光顯微鏡時，不推薦使用Cy5。

【藻紅蛋白或藻膽色素蛋白-Phycoerythrin（PE）熒光標記二抗】

存在于被稱為藻紅的多聚微粒中，位于葉綠素的反應中心，在自然結構中，藻紅蛋白吸收光能，吸收后轉化成能量，供其發育生長。當藻紅蛋白被分離和純化后，其蛋白質變得具有很強的熒光，能吸收不同波長的光，發出亮紅色的熒光，此時不再接受任何外來的光，也不能轉移光能。藻紅蛋白PE的吸收波長范圍較廣，zui大的吸收波長為566nm，zui大的發射波長為574nm。藻紅蛋白作為熒光標記物具有以下優點：首先具有強的長波長激發和發射熒光，可避免來自其他生物材料熒光的干擾；并且具有*的發射量子產率；另外PE具有非常高的水溶性而且與許多生物學或合成材料的多位點穩定交聯。

【Aminomethylcoumarin Acetate （AMCA）】

耦聯的AMCA吸收光波長zui大為350nm，發熒光則為450nm。對于熒光顯微鏡來說，AMCA可以用汞燈來激發，用紫外濾板來觀察。由于AMCA的信號相對較弱，單標實驗中不推薦使用AMCA。AMCA和熒光素的熒光波長只有很小的重疊范圍，而和發出長波長熒光的熒光基團沒有或者只有極少的重疊，因此它zui常用于多標記實驗中，比如免疫熒光顯微鏡和流式細胞儀。由于人眼不能很好的檢測藍色熒光，在多標記的實驗中，AMCA耦聯的二抗應當被用于檢測大量的抗原。AMCA和熒光素一樣很快淬滅，使用抗淬滅劑可以減輕。且由于肉眼不能很好的檢測AMCA所激發的藍色熒光，因而AMCA耦聯的二抗更適用于檢測大量存在的抗原。如果使用在流式細胞儀中，AMCA可以用汞燈或者水冷卻的氬光燈激發，因為它們發出的光線是在光譜的紫外區。

注：由于觀察熒光需要一定波長的激發光，必須根據實驗室已有的儀器可發光的波段進行選擇。另外，多標記中對探針色彩區分程度的要求。例如，若丹明紅-X （RRX）和德克薩斯紅（TR）熒光素的區別就比四甲基若丹明（TRITC）或者Cy3的區別明顯。如果對靈敏度有更高的要求，則Cy3和Cy5就比其他的熒光團探針要亮。

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