封閉的原理：

固相載體表面（如ELISA板，NC膜或者PVDF膜上等）有很多洞洞，通過電轉或包被，膠上的蛋白被轉移到了膜上，或抗原/抗體固定在板上，蛋白以機械填補（堆積）和吸附的方式結合于表面。

蛋白塞進了表面的很多洞洞里面，但蛋白并不是連續的，有很多空隙，而且比如說樣品孔之間也有空隙，這些洞洞并沒有填進東西，而抗體也是蛋白，也會被吸附在空的洞里，這樣，就會有很多非特異性的信號。

封閉液中的蛋白可以與表面上的空白位置結合，同樣以機械填補（堆積）和吸附覆蓋的方式結合在膜上，因為有“填補”和“覆蓋”蛋白結合位點以避免一抗的非特異結合，所以有“封閉”的說法。同樣這兩種作用使封閉液中的蛋白能夠很牢固的結合在空白位置上。這樣，抗體蛋白就不會被非特異性的吸附到膜上，而只會跟特異性蛋白結合。

封閉劑應封閉所有的未結合位點而不替換表面上的靶蛋白、不結合靶蛋白表位、也不與抗體或檢測試劑有交叉反應，

封閉所用試劑：

1、 BSA

BSA是zui常用的封閉劑，成分單一適用于大多數情況。若免疫原是偶聯BSA的， BSA有很強的免疫原性，會導致產生很多的針對BSA的抗體，為避免交叉反應，不能用BSA、脫脂奶粉等封閉，可以選用酪蛋白或無蛋白的封閉劑封閉。

大部分BSA中有少量的抗體殘留，會導致抗原/抗體之間的交叉反應，產生高背景，雜帶較多或使得本底水平增高。

2、 血清

封閉血清的原理主要有兩點，*是待檢樣本會有些與蛋白非特異性結合的物質，從而導致背景過高，因此可以用BSA或血清封閉掉這部分非特異性的結合，從這點看，BSA和血清沒有明顯區別。第二是待檢樣本中可能會有Fc受體，可以和抗體恒定區結合，與抗體特異性無關，封閉血清中有抗體，因此用血清可以封閉掉一抗及二抗和樣本Fc受體之間結合。BSA則無法封閉Fc受體。

免疫組化中用血清封閉的較多。封閉血清一般選擇和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預先能和組織中有交叉反應的位點發生結合，否則在后面的步驟中如果和二抗發生結合， 會造成背景。但要注意封閉用血清中不能含有目標蛋白，且與一抗來源不同。另外二抗因盡量少選取兔子或老鼠來源的，因為這兩個在親緣關系上和人類非常接近，所以產生交叉反應的機會就比較大，從而導致背景比較高。!適合選用來源于驢，山羊，綿羊等的二抗，背景相對就很低。

3、 脫脂奶粉

脫脂奶粉zui大的優點是價錢便宜，所以是，但是由于成分相對復雜，所以適用范圍要狹窄一些。磷酸化抗體也許會導致背景增加，此外，因為自身含有生物素,不能用于生物素標記的抗體系統。

奶粉蛋白種類比BSA多，而WB膜也好，ELISA板也好，表面的微結構都不是那么均勻的，相對而言，不同分子量蛋白種類多的奶粉（BSA只是一種蛋白），封閉起來更全面。

脫脂奶粉中含有少量的生物素和堿性磷酸酶殘留，在使用生物素-親和素系統和堿性磷酸酶標記的二抗時，也會使得高背景或本底水平增高。

由于奶粉的成份復雜，而且封閉后的載體不易長期保存，因此在試劑盒的制備中較少應用。

4、 酪蛋白

和BSA作用類似，普通酪蛋白不易溶解。中性和堿性條件下帶有負電性，與同樣帶負電荷膠體金之間存在排斥力，而膜一般都是帶正電荷，會與酪蛋白有一定的吸附作用，用酪蛋白封閉效果好些。

5、 無蛋白化合物

甲醛：與PVDF膜表面的微結構反應或者結合，使之失去結合蛋白的疏水力或者空間結構域。

去污劑（吐溫-20）：有抗原修復的作用，與膜疏水性吸附，有很強的對非特異性吸附的洗脫作用，同樣可以降低蛋白間的疏水作用，可提高特異性抗體的識別能力。

還有明膠，PEG等也可作為封閉劑。