免疫球蛋白分離的方法很多，IgG分離純化時(shí)多采用離子交換法，本文就采用SPA-sepharose cl-4b 親合層析法分離純化IgG的原理、試劑、操作步驟以及注意事項(xiàng)進(jìn)行了總結(jié)。

一、原理

葡萄球菌a蛋白（SPA）具有與多種哺乳動(dòng)物IgG分子fc段結(jié)合的能力，并與不同IgG亞類的結(jié)合力有所差別。改變pH及離子強(qiáng)度可洗脫結(jié)合于SPA-sepHarose cl-4b 柱上的IgG或不同的IgG亞類，可直接純化血清或小鼠腹水中的IgG抗體。

二、試劑器材

1、spa-sepharose cl-4b （pharmacia-sigma）

2、磷酸緩沖液0.1mol/l pH8.6+0.02% NaN3

3、枸櫞酸緩沖液

0.1mol/l pH5.5 0.1mol/l pH4.0

0.1mol/l pH3.0 分別+0.02% NaN3

4、1mol/l pH9.0 tris-HCl溶液

5、再生緩沖液

（1）0.1mol/l tris含0.5mol/l NaCl調(diào)整pH至8.6+0.02% NaN3;

（2）0.1mol/l 醋酸鈉含0.5mol/l NaCl調(diào)整pH至2.2+0.02%NaN3。

三、操作步驟

1.用0.1mol/l pH8.6磷酸緩沖液浸泡SPAF-sepharose cl-4b凝膠，15min。按1g干膠200ml上述緩沖液充分洗滌凝膠，（用玻璃漏斗過濾或置燒杯中洗滌）。

2.裝柱后用0.1mol/l pH8.6磷酸緩沖液平衡。

3.標(biāo)本可用硫酸銨粗提物，先10000g離心除去雜質(zhì)，必要時(shí)用0.22μm濾膜過濾，上樣前用1mol/l pH9.0 tris-HCl 液調(diào)整標(biāo)本液pH至8.6或?qū)ζ胶庖和肝觥?/p>

4.加樣，一般按25～30mg IgG/g濕膠比例加樣，室溫作用15min，用0.1mol/l pH8.6磷酸緩沖液充分淋洗，到淋洗液OD值為<0.02。

5.用不同pH的枸櫞酸洗脫液洗脫，流速20ml/h。如純化小鼠IgG1一般用pH5.5;純IgG2a用pH4.0 ;純化IgG2b用pH3.0

6.用（2）再生緩沖液洗脫剩余蛋白，洗脫后用（1）再生緩沖液平衡完成再生

7.收集洗脫液測OD值，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要透析除鹽后進(jìn)行濃度、純度和活性測定。

四、注意事項(xiàng)

1、PA-sepharose cl-4b凝膠價(jià)格昂貴，可再生后反復(fù)使用10～20次左右。

先用10倍柱體積0.1mol/l pH8.6 tris含0.5mol/l NaCl溶液洗脫柱上的殘存雜蛋白;再用10倍柱體積0.1mol/l pH4.5醋酸鈉緩沖液含0.5mol/l NaCl溶液洗脫柱上的殘存雜蛋白;0.1mol/l pH8.0磷酸緩沖液平衡，4℃貯存。

2、SPA-sepharose cl-4b親合層析法還可用于

（1）除去抗體液中IgG，檢測非IgG抗體（如IgM）的生物學(xué)活性

（2）除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段

（3）吸收或純化免疫復(fù)合物

3、狗、貓的多克隆IgM和IgA以及單克隆IgM和IgA也具有與SPA結(jié)合的能力。

使用PA-sepharose cl-4b分離純化IgG主要有以下三個(gè)優(yōu)點(diǎn)：一、操作簡單，可進(jìn)行大規(guī)模操作；二、純化產(chǎn)率高、特異性強(qiáng)；三、使用范圍廣，可以純化IgG，也可以用于純化IgM，但是主要的缺點(diǎn)就價(jià)格比較貴。