使用說明書

檢測原理

試劑盒采用雙抗原一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預

先包被人抗AECA抗原的包被微孔中，依次加入標本、HRP標記的檢測

抗原，經過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的

催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。用酶標儀

在450nm波長下測定吸光度（OD 值），與CUTOFF值相比較，從而判

定標本中人抗內皮細胞抗體（AECA）的存在與否。

樣品收集、處理及保存方法

1. 血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞

刺激，收集血液后，3000 轉離心10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地

分離。

2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉離心30 分鐘取上清。

3. 細胞上清液：3000 轉離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。

4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉離心10 分鐘

取上清。

5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于

-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

1. 酶標儀（450nm）

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

操作注意事項

1. 試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20 分鐘。從冰箱取出的

濃縮洗滌液會有結晶，這屬于正常現象，水浴加熱使結晶*溶解

后再使用。

2. 實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。3. 預處理后的樣本無需稀釋，直接取50μL 加樣即可。

4. 嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。

5. 所有液體組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成

名稱96孔配置48孔配置備注

微孔酶標板12 孔×8 條12 孔×4 條無

陰性對照0.5mL 0.5mL 無

陽性對照0.5mL 0.5mL 無

檢測抗原-HRP 10mL 5mL 無

20×洗滌緩沖液25mL 15mL 按說明書進行稀釋

底物A 6mL 3mL 無

底物B 6mL 3mL 無

終止液6mL 3mL 無

封板膜2 張2 張無

說明書1 份1 份無

自封袋1 個1 個無

試劑的準備

20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20 稀釋，即1 份的20×洗滌緩

沖液加19 份的蒸餾水。

洗板方法

1. 手工洗板：甩盡孔內液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min 后甩盡

孔內液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5 次。

2. 自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5 次。

操作步驟

1. 從室溫平衡20min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封

袋密封放回4℃。

2. 設置陰、陽性對照孔和樣本孔，陰、陽性對照孔中加入陰性對照、

陽性對照各50μL；

3. 待測樣本孔加待測樣本50μL；

4. 隨后陰、陽性對照孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）

標記的檢測抗原100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫

箱溫育60min。

5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去

洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5 次（也可用洗板機洗板）。

6. 每孔加入底物A、B 各50μL，37℃避光孵育15min。7. 每孔加入終止液50μL，15min 內，在450nm 波長處測定各孔的

OD 值。

結果判斷

1. 試驗有效性：陽性對照孔OD 值平均值≥1.00；

陰性對照孔OD 值平均值≤0.15。

2. 臨界值（Cut off）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15

3. 陰性判斷：樣品OD 值＜臨界值（Cut off），樣品為陰性

4. 陽性判斷：樣品OD 值＞臨界值（Cut off），樣品為陽性

試劑盒性能

1. 準確性：陽性對照孔OD 值平均值≥1.00；陰性對照孔OD 值平均

值≤0.15，說明試驗結果有效。

2. 特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。

3. 重復性：板內、板間變異系數均小于15%。

4. 貯藏：2-8℃，避光防潮保存。

5. 有效期：6 個月

免責聲明

1. 試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實驗或人體實驗，否則所

產生的一切后果，由實驗者承擔，本公司概不負責。

2. 嚴格按照說明書操作，實驗者違反說明書操作，后果由實驗者

承擔。