蘇州市萊頓科學儀器有限公司

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液相色譜柱使用方法和養護

誤區一：HPLC柱不可反沖
    否。通常液相色譜柱的設計的耐壓值遠高于zui大操作壓力（大約2倍）。因此，對于穩定的填料床，如果使用合適的流動相和合理的時間分配，填的好柱子能夠左右開弓。反過來使用HPLC柱的原因有以下幾點：換柱時反沖，清洗柱頭強吸附的物質，以及沖洗出殘留物質防止壓力增大。
   
    但是有一個特例，如果廠家在柱頭使用了大粒度的填料，反沖會沖出這一部分填料。通常而言，出口處的填料粒度要比整支柱子zui小的還要小。比如標稱5μm的粒度，實際粒度在3-7μm，則出口處的粒度必須比3μm要小，這才能夠保證柱子末端的填料不會被沖出去。
   
    那么為什么廠家要在入口和出口處使用不同粒度的填料呢？因為大粒度的不容易堵，比如0.5μm的柱子比起同樣2μm的柱子更容易堵塞。因此為了避免壓力的快速升高，就要生產出更加有容差，大粒徑填料入口的柱子。
   
    博主注：柱子能不能反沖從我一開始接觸就遇到了，有時候不管能不能，若是進過了臟東西，非要這樣做不可，因為不可能讓它沿著柱子跑一遍，費時費錢。實際上，能不能反沖直接決定于填料床的模型和實際填料到底有什么“添加劑”在里面，而這些資料waters，agilent，Phenomenex是不會給我們的。經驗表明，反沖效果的是菲羅門，手上的不論是luna還是Synergi，都能夠這樣，其中一支更是創下了實驗室反沖柱的神話–正過來壽終正寢，結果反過來又*，用了接近一半的壽命，汗|||
   
    誤區二：所有的C18（L1）柱都相同
    否。早期HPLC體系中，C18是*的反向色譜的鍵合固定相，因此C18就作為了反向色譜柱的標準并且許多*也樂于使用。因為醫藥工業zui先采用HPLC，并且管理機構也不愿意廠家搞出新花樣。FDA和USP也給出了提交新藥品應用時設計的分析方法分類。給予了C18的HPLC柱子分類為“L”，因為C18色譜柱大部分作為提交新藥的方法柱，C18就成為了L1，就是*個標準柱。但更多的固定相出現，就以新的L值命名。（L7=C8，L10氰基，L11苯基）。
   
    問題來了，因為商品化的C18合成條件不同，使用的不盡相同的作硅膠基體材料，就導致了反向柱有不同的性能。比如說：有的廠家使用一氯甲基硅烷，和小表面積的硅膠（如圖），又有的使用同種硅烷，但是鍵合在大表面積硅膠上。這樣就會導致大表面積的更像C18。低鍵合相優勢會有未反應的硅醇羥基，能夠導致混合的樣品保留機理。所以廠商就使用二氯或者三氯硅烷，可以使硅烷流動屬性降低，鍵合相就會薄一些。而為了使沒有反應完的硅醇羥基消失，廠家就用小烷基封端來屏蔽（如三乙基氯硅烷）。硅醇基是中pH條件下簡單化合物拖尾的始作俑者。所以許多廠家使用了雙封端技術，就是用第二個小的硅烷來獲得更加惰性的表面。廠家也使用了聚合物材料作為基體，然后多多少少鍵合C18，這就導致了柱子C18總量參差不齊，但依然還是作為C18（L1）來作為標準柱。也有的使用純烷基硅烷鍵合，那么就表現出不同的反應特性，提供了與氯硅烷不同的C18鍵合相條件。
   
    所以呢，此C18非彼C18在今天看來特別有意義。龍生九子，子子不同，因此用戶分析開發的時候需要一致的柱子來獲得穩健的方法。研究人員也開始研究哪些C18有類似的保留特點和選擇性。所以就發現有的C18便顯出*與C18相反的特性。
   
    博主注：只知道C18悠久，沒有想到這么早，一般認為封端的就好些，比如大連國產的那個，用著用著柱效下降很快，我就認為和這個鍵合啊，封端啊有關系。

誤區三：保護柱不影響分離效果
    否首先，配一個保護柱很好。如果固定相選擇錯誤，保護柱也能夠對分離有效果。要明確的是：保護柱是保護分析柱避免被高殘留的組分污染用的，尤其是那些不想進讓它柱子的部分。保護柱比起分析柱便宜許多，所以污染的保護柱能夠替換的更加勤。
   
    理想的結果是，保護柱的固定相和分析柱恰好相同。如果固定相保留強（如高載碳量和混合相），就能夠使得保留便宜而影響分離，甚至導致不同的選擇性。如果保留弱，問題就不那么明顯，除非固定相影響整個體系選擇性。
   
    為了使保護柱zui小化的影響分離，保護柱需要合適的裝配。顯然，保護柱安插在進樣口和分析柱之間，但是如果管路太長（太長或者內徑太大），就會造成額外的峰展寬，從而影響分離。系統引入整合保護柱，從以往的報道看，基本上會達到分析柱的*水平。但是，整合保護柱基本上和卡式色譜柱捆綁，因此不是那么流行。從操作的角度說，應當在不影響HPLC系統的前提下容易卸下和更換。
   
    理論上，如果保護柱延長了柱長，那么就對色譜分離有額外的塔板數。但就像前面說的，保護柱要么在*條件使用，要么在zui糟糕的條件下除去。所以保護柱的優勢就是延長柱壽命，而沒有帶來總體分析效率的提高。
   
    博主注：zui早接觸保護柱，或者叫預柱，實在接觸waters設備的時候，兩個圓圓的蓋子，儀器標配，缺點是不銹鋼管路還那么長，簡單的保護部分被拉出一大截死體積，后來菲羅門也送保護柱過來了，千把來塊錢，一直放著也沒有用，說句實話，筆者不是很喜歡用這個做保護，原因就在于覺得影響效果。
   
    誤區四：提高溫度往往有利于分離效果
    否。隨著溫度升高，流動相粘度下降，因此分析物傳質速率提高，所以就能夠提供更好的色譜分離效果。正確，但是除了柱效，溫度同樣影響保留因子（k）和選擇性（α）。影響因素能夠提高分辨率（其實這也是色譜分析zui關心的問題），或者降低分辨率。保留時間往往隨著溫度升高而降低，因為溫度作為一個熱力學參數，使得高溫度下分析物傾向于留在流動相中，會更快的洗脫出來。但是，不同的化合物，也有可能對于溫度有不同的保留程度改變。以analgesics（一種鎮痛藥，譯者注）為例，圖二。這一系列的色譜圖列出了分析物在柱溫20-90°C的情況。我們從中可以發現許多特點。首先，所有分析物隨著溫度升高，保留時間減低且峰變窄，意味溫度升高利于分離效果。其次，salicylic acid（水楊酸即阿司匹林，譯者注）在峰5，6之間，隨著溫度位置改變較大。事實是在20-40°C時，該物質隨溫度變化，洗脫順序也發生了變化。所以，溫度大于40°C會引起分離時間變短和洗脫順序變化。
   
    當然，一個提高溫度的好處在于降低了操作時的柱壓，以便于使用更大的柱流量和更細的填料。
   
    另一個在高溫下能夠因此柱效的實驗參數是流動相的熱力學不匹配（互溶問題，譯者注）。如果柱子在60°C下操作，但是流動相在室溫流入，那么進入的較冷的流動相就能夠引起峰變形，原因是不同溫度下分析物會趨向在高溫的流動相中。所以建議大家使用恒溫柱子的時候一定記得流動相要預熱。
   
     博主注：溫度對出峰時間的影響是顯然的，武漢這邊的夏天熱，液相色譜室這邊一般都不愿意把門關上，所以空調以往這邊吹，出峰就靠后，waters，agilent 一般沒有配柱溫箱，varian，島津的喜歡推廣這個，對于穩定保留時間很有作用。不過我覺得平常的實驗室，流動相怎么放，色譜柱也怎么放，不然就像上面說的，流動相里的分析物經不起溫度的折騰。畢竟不論DAD（PDA）還是UV測得是濃度，變形了測得就不太準了，0.15%很容易突破的。
   
     誤區五：碳載量越高，反向色譜柱就越好
     否。談到烷基鍵合相是，這樣的結論肯定是對于鏈長、載碳量和表面積等有概念誤解。通常，真正的反向機理是，保留取決于分析分子的疏水性質，所以保留一般取決于載碳量。載碳量越高，保留越長。載碳量一般與鏈長對應，但有時候不是。典型的硅膠反應的硅醇含量在8.0 μmol/m2左右，用來鍵合有機硅試劑。如果對于一個每平方米微孔相同的單層鍵合相，給定的表面范圍，鏈長越長，載碳量就越大，zui終的結果是保留與鏈長一致。但是對于短鏈鍵合相（比如C8），如果基體變面積大，那么鍵合的碳就會更多，就會可能導致比C18更加長的保留。此外，廠家使用二硅烷和三硅烷，以及聚合物基體也能取得較大的表面積，所以短鏈聚合相就會在這種情況下帶來單聯鍵合所不具有的表面積。對比單體鍵合相，有時候上述的這些聚合物基體的鍵合表層較薄，引起傳質較慢。
   
    高載量的反向柱更加容易坍塌和反潤濕。對于這些柱子，當環境水樣中的機修飾劑降到10%的時候，類油的疏水固定相就會變得自我關聯（self-associate），而不是作為極性溶液（即相似相溶）。所以，在此情況下，高碳載量理應并不利于反向色譜也不利于色譜重現性。
   
      博主注：賣主子的公司都喜歡談論這個指標，什么資生堂，迪馬的柱子在介紹的時候碳載量是放在顯著的位置的。平心而論，碳載高的柱子制造難度大，同時分析我手上小分子的時候還真是好些，目前還沒有發現碳載高的柱子塌掉的情況，可能做的還不夠多吧。
   
    誤區六：使用小粒徑的分析效果好
    否。對于一個裝填的色譜柱而言，隨著裝填粒徑的減小，柱效提高，但是如果附加柱（應該指保護柱，或者冗長的管路系統 譯者注）對色譜系統對譜帶展寬影響足夠明顯，那么，色譜柱的粒徑影響就不容易發覺。這些附加柱效應影響列舉如下：
    1. 進樣體積，包括進樣環，以及進樣閥的額外體積
    2. 管路體積，包括從進樣閥（器）出口到色譜柱入口
    3. 保護柱的間隙和適配器
    4. 在線過濾器體積
    5. 色譜柱入口到色譜填料之間的一段距離的體積
    6. 色譜柱間隙體積
    7. 色譜柱色譜填料到出口的一段距離的體積
    8. 色譜柱出口到檢測器入口的管路體積
    9. 檢測器入口到流通池的管路體積
    10. 流通池體積
    上述均為附加體積（就是死體積，介紹的比較全面 譯者注）。因此，能夠做的就是把進樣量zui小化，保持色譜柱入口前的管路盡可能短，內徑盡可能小。如果色譜柱出口到檢測器的管路合計1米長，內徑0.5mm，譜帶展寬就會*影響色譜分離效果。所以，想要在小于2μm或者1.0mmde 微孔柱上得到好的效果，就要要保持“附加柱”盡可能的短。
    博主注：與其使用更好的柱子，還不如優化下色譜體系。每每拿到柱子就看一下柱子驗證報告，不論是國內廠商，還是老美，這個報告我都是深信不疑的，如果拿了同樣的標樣做不出來，那zui可能的原因就是系統沒有優化。人家出廠測試的時候，管路都是盡可能的短，盡可能的細，流動相是盡可能的純，沒法比，但至少自己優化了比沒有優化還是有區別的。

   
    誤區七：對于硅膠填料，硅醇基是拖尾的原因
    否。在特定場合，出現在硅膠基鍵合柱上的硅醇基，尤其是分析堿性化合物，能夠造成拖尾。拖尾的原因在于硅醇基團就是一個弱酸，pKa大約在4.5和4.7之間。因此如果流動相pH值在4到5的時候，硅醇就會離子化，與正電荷分子離子反應，比如通過靜電作用于氨基的H反應（Si-O-----H-N 譯者注）。該反應可以通過減小pH到3阻止離子化來減小。但是對于許多堿性化合物，在低pH條件下也能夠發生拖尾。而對于堿性化合物的拖尾，要得到好的峰形，就需要特別設計的反向色譜柱了。
    三種原因能夠造成拖尾，化學問題（之前已經討論過），柱填充問題，色譜設備硬件問題。三種問題都可以造成拖尾，但是要解決問題，就需要找到問題的根源。詳細的討論需要千言萬語，所以這里就只給出解決問題的大概方向。首先，與硅醇基的反應問題，化學因素的拖尾能夠用多種方式表現出來。早期色譜柱，可以發現金屬螯合劑能夠和柱子中痕量金屬反應。因此，錯誤的進樣溶劑就能夠導致拖尾（-CN 螯合，譯者注）。使用比流動相強的溶劑進樣也能夠導致峰扭曲。（如甲醇配樣，乙腈做流動相 譯者注）。拖尾還可能來自于柱頭處，樣品中不容易洗脫出的物質，和流動相的雜質。這些物質能夠與不同的固定相反應，然后在分析物經過的時候發生影響（雜質占位，不保留 譯者注）。流動相混合模式偶爾也能夠誘發拖尾（應該指的是四元單泵 譯者注）。分析物與固定相作用，離子化合物與活性基體作用。有時候，流動相pH錯誤，樣品部分離子化，就能夠導致峰扭曲和拖尾。此外，色譜背景峰上的小峰，看上去也有點拖尾。
    柱子的填充質量也可以導致拖尾。柱頭的填料空隙可以導致分叉或者拖尾。如果柱子沒有填充好，有凹槽（可以是硅膠上的小洞， 譯者注）就能夠因此峰形過寬。樣品含量過大會導致拖尾（一般是后拖前不拖）。如果進得少了，因為柱子上過度的硅醇反應，也能夠導致拖尾。
    第三個來討論下儀器硬件問題。前面說的管路死體積（extracolume）和接頭體積能夠導致拖尾。進樣口的瞬間加壓可以造成柱子和流動相之間的空洞從而加劇拖尾。反應比較慢的檢測器用來檢測快速洗脫出的分析物時會形成峰展寬和拖尾（和流通池厚度，長度有關 譯者注）。前文中說的柱操作溫度和流動相溫度不匹配自然也會引起。
    所以，造成HPLC拖尾的不總是硅醇基。
    博主注：液相色譜天生的峰就寬，比不上GC或者電泳，看著就羨慕，誰叫它是靠壓力在水里走呢？柱子里走的路徑不同，還有空隙里中間快，靠邊的慢，相比之下，就是正常的峰形，都覺得有些拖。把硅醇封端不光是為了防拖尾，還有個作用就是防坍塌，用個小基團在C18、C8后面頂著，柱子也耐用一些。
   
    誤區八：硅膠填料只能夠在pH2到7使用
    通常有兩種HPLC反向柱的化學退變機理：在低于pH2的時候硅氧鍵催化水解；在pH大于7或8的時候，被水中-OH溶解。pH小于2的時候，-Si-O-Si-可以被H3O+進攻，固定相就會流失斷裂。隨著時間的推移，隨著載碳量下降保留值會慢慢下降。這種情況在由*基硅烷等短鏈封端的色譜柱時，應當尤為注意。長鏈C18固定相因為空間位柱效應，對于這樣一種流失有一定的保護作用，但是zui終仍然是慢慢被侵蝕，尤其是溫度高于環境時。空間保護、密度圖層鍵合固定相有助于防止硅膠鍵合相的流失。聚合物固定相在這種條件下表現良好，但是比起硅膠固定相的柱效要低。
    在高pH方面，一定需要有保護硅膠基體免于羥基進攻的措施。一旦溶解過程開始，隨著固定相被掏空，色譜柱會zui終失效。所以開發了雙硅烷交聯C18（bidentate C18），雜交等耐高pH的特種色譜柱。這些柱子都使用了化學方法來保護固定相避免羥基的洗脫。上述的特種柱子能夠承受pH11-12的條件。在此堿性，pH條件下，柱子要避免高溫使用。當然，聚合物色譜柱能夠在pH13甚至14的條件下使用，但是，前文已經指出，聚合物柱比硅膠柱效果要差些。
     因此，在這個論點上，硅膠柱能夠在pH2-7以外的范圍使用，但是普通硅膠色譜柱要格外小心，由其是在高溫條件下。
    博主注：再一次提醒自己，pH的使用是液相色譜的精髓之一。怎么調節，物質在等pKa的pH條件下出峰時間中等，堿性在高于pKa，酸性低于pKa時保留時間延長，峰形也漂亮，反之出峰快，峰形不好說。除了這個，估計什么都要靠運氣了。
       
    誤區九：當代HPLC柱至少應該承受1000次進樣
   否。現代HPLC色譜柱能夠承受的進樣數量由許多因素決定。有些因素基于以下模式：反相色譜，離子交換色譜，排阻色譜，正相色譜，手性色譜，親水交互色譜等等。有些因素基于不同的填料基體：硅膠基質，雜交基質，氧化皓基質，聚合物基質等填料，或者是基于不同的硅膠軟硬程度和涂層的交聯程度。有些因素基于固定相本身：空隙率，鍵合方式，聚合，單層鍵合，或者包埋方式。其他的因素就和條件有關了：pH，溫度，流動相組分，緩沖組成，流動速率，壓力等等。還有些和樣品有關：*標樣，潔凈樣品，樣品pH，樣品體積（含量），樣品雜質，分析物分子本身特性等。
  　如果一根柱子被濫用，比如在pH范圍外，或者流速范圍外，很有可能連50次進樣都成問題。如果每次樣品都沒有什么雜質，5000次使用也不為過。如果色譜柱不總是在其承受力上限使用，壽命會更長。如果柱子進入多種多樣的樣品，但是從來不沖洗柱子里的殘留，壽命必然減少。
    筆者（原作者 譯者注）對于許多制藥公司的經驗表明，絕大多數5μm反向色譜柱在分析物質結構，簡單藥品混合物，和標樣的情況下能夠承受至少1000次測試。如果樣品“很臟”，比如沒有嚴格*的凈化生物樣品提取物，環境樣品提取物，1000次進樣是有待考驗的。
    所以說柱子能夠承受的次數不是的，而是取決于柱子的類型（本身體質和適用范圍 譯者注），操作條件，樣品潔凈程度和濫用程度。即使有些儀器能夠記錄柱子的使用，實際上只有不到15%的研究人員記錄了色譜柱能夠用的次數，很多研究人員都不知道到底能夠用多少次
   博主注：用儀器的都知道要保養，奈何就是有人把過粘，過臟的東西一針一針的往里打，這樣的慘劇博主不是*次見了：純的油質，黃黑色的，20μL，卡嚓一針進了六通閥；50uL當5uL的針裝在自動進樣器上，不設延遲時間，直接卡嚓往GCMS里面搞，還要不要儀器了，要不要人活。所以說，樣品要接近，溶劑要過膜超聲。
     
    誤區十：色譜柱總是應該緊緊的密封，以防被填料被空氣破壞
   否。通常色譜柱兩頭的小孔不到0.5mm，所以如此小的區域，空氣進入色譜和流動相蒸發很小。即使是一個小氣泡進入色譜柱，也不能夠有足夠時間來進入填料床，接觸足夠的固定相而造成損害。假若柱子中有了這么個小的氣泡，只要裝在色譜設備上運行一次，在高壓下會立即溶解，然后流出色譜柱，不會有任何危害。當然，如果你為了保險，死死的擰緊也行。柱子也都配備了螺紋柱塞（原文是 male compression fitting caps, 英文的這個傳神，翻譯不出來那個感覺，罷了 譯者注），手動就能夠擰緊，以防止溶劑蒸發，空氣進入填料。

    博主注：原文那個“male compression fitting caps”形象的不行，男人干的活。實驗室里的小mm每當要換柱子的時候，就是我等展現男人魅力的時候了，不論是用扳手擰金屬頭，還是用手擰peek頭，都不在話下，哪怕是柱頭在高壓下，噴的到處都是。至于用完的柱子，還是老老實實把C18要水和乙腈混著，原裝的peek頭擰緊，原文指的是在運行的時候松緊問題。