嬰幼兒奶粉中雙氰胺的檢測方法（HPLC-UV和HPLC-MS/MS法）

來源：天津博納艾杰爾科技有限公司（飛諾美） 2013年01月30日 01:49

北京時間1月25日凌晨消息，新西蘭牛奶中發現了有害物質——雙氰胺。雙氰胺又名二氰二胺，縮寫DICY或DCD。雖然標準未對食品中的雙氰胺*，但高劑量的雙氰胺對人體是有毒的。
針對嬰幼兒奶粉中基質復雜的特點，本方法加大了凈化材料的用量，以獲得了更好的凈化效果。采用天津博納艾杰爾科技的新一代的Cleanert® MAS-QuChERS-雙氰胺凈化管（500mg/15mL，貨號：MS-SQA02）和Venusil® HILIC液相色譜柱，建立了奶粉中雙氰胺的MAS-QuEChERS快速前處理方法和LC-UV以及LC-MS/MS檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料
液相色譜儀，渦旋振蕩器，超聲波清洗機，氮吹儀。
雙氰胺標準品（CAS： 461-58-5；FW=84.08），新一代Cleanert^® MAS-QuChERS-雙氰胺凈化管，Venusil^® HILIC液相色譜柱，微孔濾膜，乙酸銨、乙酸、乙腈為色譜純，實驗用水為超純水。

1.2 實驗步驟
稱取1g試樣于50mL具塞離心管中，加2mL水，渦旋30s，加2ml乙腈渦旋30s。再往現有的提取液中加2mL乙腈，重復上述提取步驟。再將該提取步驟重復2次，得到共計約10mL的提取液。以4000r/min離心5min，將全部上清液加入新一代Cleanert® MAS-QuChERS管中（500mg/15mL），將MAS管上下晃動30s，然后渦旋30s后，8000r/min離心5min，取全部上清液（約10ml）于玻璃試管中，50℃下氮氣吹干，加入1ml乙腈復溶，過0.22μm微孔濾膜，待測。
注：1.做基質加標實驗時的標準溶液建議選擇以水為溶劑，防止加標瞬間發生蛋白沉淀；
2.乙腈提取分4次，為防止乙腈體積過多時沉淀蛋白速度過快，影響提取效果。

1.3　實驗條件
1.3.1液相色譜法（HPLC法）：
色譜柱：Venusil® HILIC（5μm，100Å，4.6*250mm）；
流動相： 10mmol/L乙酸銨（pH=4.0）：乙腈=15: 85；
波長：220nm；進樣量：10µl；柱溫：30℃；流速：0.8mL/min。
1.3.2 LC-MS/MS法：
（1）色譜條件：
色譜柱：Venusil® HILIC（ 5μm，100Å，2.1*150mm）；
流動相：A：0.5mmol/L乙酸銨（pH=4.0）
B：乙腈；
進樣量：10µL；柱溫：30℃；流速：0.3 mL/min。

表2 流動相梯度程序

時間，min	A%	B%
0	10	90
0.4	50	50
1.8	50	50
1.9	10	90
7	10	90

*備注：本文曾嘗試過多種C18色譜柱，對雙氰胺沒有保留，需要使用離子對試劑，但是無法用于LC-MS/MS；也曾嘗試過MERCK ZIC-HILIC柱，但是得到雙氰胺的峰面積偏差較大，分析原因是其具有陽離子交換基團，對雙氰胺有不穩定的死吸附。zui后確定使用鍵合丙基酰胺的Venusil HILIC柱，以親水作用色譜機理對雙氰胺進行保留。
（2）質譜條件：
質譜儀：API 4000+；離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測；CAD：8.00；CUR：20.00；GS1：60.00；GS2：50.00；IS：5500.00；TEM：600.00。

表3雙氰胺質譜信息

藥物名稱	監測離子對	DP	EP	CE	CXP
雙氰胺	85.1/68.1	71	10	41	6
	85.1/43.1	71	10	41	6

注：帶“____”的監測離子對為定量離子對。

2.結果與討論

2.1 液相色譜法：
2.1.1雙氰胺的液相色譜圖

2.1.2實際樣品基質加標的線性關系和檢出限
準確稱取雙氰胺標準品50mg于50mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，作為標準貯備液；
分別稱取1g奶粉試樣，添加一定量標準溶液，配制成含雙氰胺為0.5µg/g，1µg/g，2µg/g，5.0µg/mL和10µg/g的添加樣品，按照上述提取、凈化方法操作，所得凈化液按照上述色譜條件，依次進樣檢測。以雙氰胺含量為橫坐標，峰面積為縱坐標，擬合線性方程，結果見表4：

表4 雙氰胺線性方程和定量限（HPLC法）

名稱	保留時間	線性方程	相關系數	zui低定量限（S/N=10）
雙氰胺	5.57min	Y=108.16X+27.827	0.9971	0.5µg/g

2.1.3準確度和精密度
選取市售某品牌嬰幼兒奶粉試樣，進行添加回收實驗，結果見表5

表5 0.5µg/g添加回收實驗結果（HPLC法）

平行1	平行2	平行3	平均值	RSD
82.3%	85.5%	89.1%	85.63%	3.97%

2.2 LC-MS/MS法
2.2.1雙氰胺的LC-MS/MS圖

2.2.2實際樣品基質加標的線性關系和檢出限
準確稱取雙氰胺標準品50mg于50mL容量瓶中，加水溶液并稀釋至刻度，作為標準貯備液；
分別稱取1g奶粉試樣，添加一定量標準溶液，配制成含雙氰胺為5ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL和200ng/mL的添加樣品，按照上述提取、凈化方法操作，所得凈化液按照上述液質條件，依次進樣檢測。以雙氰胺含量為橫坐標，峰面積為縱坐標，擬合線性方程，結果見表6：

表6 雙氰胺線性方程和定量限（LC-MS/MS法）

名稱	保留時間	線性方程	相關系數	zui低定量限（S/N=10）
雙氰胺	2.25min	Y=3859.1X+23694	0.9900	2ng/g

2.2.3準確度和精密度
選取市售某嬰幼兒奶粉試樣，進行添加回收實驗，結果見表7。采用空白樣品稀釋法判斷檢測方法的基質效應影響。空白凈化液稀釋和乙腈稀釋的標準溶液，雙氰胺峰面積和相對豐度比無明顯變化，故判斷該方法無基質效應的影響。

表7 10ng/g添加回收實驗結果

平行1	平行2	平行3	平均值	RSD
82.5%	83.5%	89.3%	85.2%	4.31%

3.產品訂貨信息

相關方法：奶粉中雙氰胺的檢測方法（HPLC-UV和HPLC-MS/MS法）

產品名稱	規格型號	貨號
新一代 MAS-QuChERS-雙氰胺凈化管（填料量加大，更適合嬰幼兒奶粉等復雜樣品）	500mg/15mL，50支/包	MS-SQA02
MAS-QuChERS-雙氰胺凈化管	100mg/2mL，50支/包	MS-SQA01
Venusil HILIC液相色譜柱	4.6*250mm，5μm，100Å	VH952505-0
Venusil HILIC液相色譜柱	2.1*150mm，5μm，100Å	VH951502-0
Clarinert微孔濾膜 Nylon（通用）	尼龍0.22μm，直徑50mm, 100/Pk	AM025020
Clarinert 針式過濾器 Nylon（通用）	尼龍0.22um，直徑13mm，200/pk	AS021320
雙氰胺對照品	500mg /瓶，含量≥99.0%	DCD-0001
雙氰胺對照品	1g /瓶，含量≥99.0%	DCD-0002
離心管	50mL，帶螺紋蓋，25個/包	LXG0050
一次性注射器	5mL,100/pk	ZSQ-5ML

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