封閉劑在細胞免疫熒光中的應用

一、固定：

PBS 5min×3次 振蕩洗滌制作好的細胞爬片。

固定液覆蓋細胞，RT 靜置15min。

PBS 5min×3次 振蕩洗滌。

二、通透化：

通透液覆蓋細胞，RT 靜置30min。

PBS 5min×3次 振蕩洗滌。

三、封閉：

封閉液覆蓋標本表面37℃孵育1h。

四、一抗孵育：

一抗以合適濃度稀釋PBS，覆蓋標本表面。

4℃孵育過夜，第二天37℃復溫1h。

PBS 5min×3次 振蕩洗滌。

五、二抗孵育：

FITC標記二抗以合適濃度稀釋于PBS，覆蓋標本表面。

37℃避光孵育<60min。

PBS 5min×3次 避光 振蕩洗滌。

六、染核：

新鮮稀釋Hoechst覆蓋細胞表面，RT避光靜置<10min。

PBS 5min×3次 避光 振蕩洗滌。

七、封片：

在干凈的載玻片上滴一滴封片劑，將爬片的細胞面扣在封片劑上。

八、鏡檢，4℃避光保存。

II、注：

1、細胞密度要合適，狀態較好。

2、從孵育二抗開始要避光（關閉室內日光燈即可）。

3、完成后及時鏡檢，照相;分別用不同波長激發熒光，在Photoshop軟件下合成一張圖。

III、試劑配制：

1、固定液：4%多聚甲醛/PBS：

4g多聚甲醛，50～80mlPBS，加熱至60℃，持續攪拌至*溶解，（通常需滴加少許1n NaOH才能使溶液清亮），定容100ml，RT保存。

2、通透液：0.5 %（v/v）TritonX-100/PBS

3、封閉液：正常山羊血清稀釋于PBS;或商品化封閉液成品。

4、Hoechst：Hoechst33258即可。

5、封片劑：50%（v/v）甘油/PBS。
 

上海勁馬實驗設備有限公司是一家專注于生命科學和生物技術領域的高科技企業。從事生物技術領域相關產品的開發，銷售和技術服務。我們的主營業務為：ELISA試劑盒，化學試劑， 胎牛血清，人血清，抗體，重組蛋白，標準品，以及耗材等。