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D二聚體（Ddimer，DD）是纖溶酶水解交聯纖維蛋白后形成的特異性降解產物，是體內高凝狀態和繼發纖溶亢進的分子標志物之一。近年來，定量檢測DD含量已成為排查深靜脈血栓（DVT）、肺栓塞（PE）、彌散性血管內凝血（DIC）等血栓性疾病的重要手段之一，并作為溶血栓治療的動態監測指標[1]。目前對DD的主要定量檢測方法為膠體金法（免疫滲濾法）和免疫比濁法。現根據臨床和實驗室標準協會（CLSI）相關文件，對兩種定量檢測方法進行評價與比較。

1 材料與方法

　　1.1 儀器與試劑

　　1.1.1 免疫比濁法采用美國IL公司生產的ACL TOP全自動血凝儀及其配套DD檢測試劑（批號：B50317）;

　　1.1.2 膠體金法采用挪威AxisShield公司生產的Nycocard Reader 血漿DD檢測光度計，及配套DD膠體金免疫滲濾試劑盒（批號：10122111）。

　　1.1.3 干擾物：膽紅素標準品（上海科華公司生產，批號：GF 62 K）、脂肪乳（主要成分為甘油三酯，華瑞制藥有限公司生產，批號：0510019）、血紅蛋白（日本試藥株式會社）。

　　1.2 標本

　　1.2.1 質控品：IL公司提供的正常及高值質控血漿;

　　1.2.2 血樣：隨機抽取住院病人及健康體檢人群新鮮全血，用109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝， 3 000 r/min離心10 min，取得乏血小板血漿，3 h內完成檢測。

　　1.3 方法

　　1.3.1 重復性實驗（批內精密度）：根據CLSI的EP5A2文件[2]對于精密度評價的要求，分別采用免疫比濁法和膠體金法，在ACL TOP血凝儀與Nycocard Reader 光度計上測定正常及高值水平質控血漿DD含量。3 h內各水平連續測定20次，計算均值（）、標準差（s）、變異系數（CV）。

　　1.3.2 穩定性實驗（日間精密度） 按上述方法，分別測定正常及高值質控血漿DD含量，每天測定1次，連續測定20 d，計算、s、CV。

　　1.3.3 線性實驗 根據CLSI [3]對線性評價的要求及免疫比濁法和膠體金法各自的線性范圍，選取DD的高值和低值病人標本，低值標本為1號，高值標本為5號，二者3∶1混合為2號，等份混合為3號，1∶3混合為4號，制備成5個濃度梯度的樣品，每個濃度樣品重復檢測4次，根據檢測結果進行線性回歸分析。

　　1.3.4 生物性物質干擾實驗 根據CLSI EP7A文件[4]對干擾實驗的相關要求，在體外向正常人混合血漿中加入不同濃度膽紅素、脂肪乳、血紅蛋白，加入的zui高濃度參考臨床標本可能出現的zui高含量及試劑說明書的說明。分別使用免疫比濁法和膠體金法測定混合血漿，根據加入干擾物質前后的測定值計算影響度。

　　影響度=（加入后測定值-加入前測定值）/加入前測定值×100%。

　　1.3.5 比對實驗 根據CLSI EP9A2文件[5]對能力比對的相關要求，選取隨機的住院病人新鮮全血標本40例，采用上述兩種方法平行檢測DD含量，每天8例血漿，連續檢測5 d。zui后對檢測結果進行相關性分析。

　　1.3.6 免疫比濁法與膠體金法DIC診斷效能的評價與比較：收集129例臨床疑為DIC的患者標本，分別采用兩種方法檢測其FDP含量，以1999年全國DIC診斷標準修訂方案作為確診標準[6]，由此評價與比較兩種方法的診斷效能，包括受試者工作特征曲線（Receiver operating Characteristic Curve，ROC）、敏感度、特異度等。

　　1.4 統計學方法 線性評價中根據理論值與實測值做相關曲線及回歸方程，獲得相關系數、截距、斜率等參數;DIC診斷效能評價中采用四格表計算敏感度、特異度。以上處理及ROC繪制均使用SPSS 11.0軟件分析。

　　2 結 果

　　2.1 重復性與穩定性 比濁法和膠體金法的重復性與穩定性實驗結果見表1。可見免疫比濁法重復性與穩定性要優于膠體金法。表1 ： DD批內及日間精密度測定結果DD

　　2.2 抗生物物質干擾 血漿的血紅蛋白、三酰甘油、膽紅素含量分別為0 g/L、80 mg/dl、1 mg/dl，加入不同濃度干擾物檢測結果見表2。脂肪乳中三酰甘油含量由AEROSET生化分析儀（雅培公司，美國）測定。結果表明，血紅蛋白達50 mg/dl、膽紅素達5 mg/dl對膠體金法檢測DD無影響，但在三酰甘油達450 mg/dl以上（中到高度脂血）時無法正確完成檢測;血紅蛋白達50 mg/dl、三酰甘油達900 mg/dl、膽紅素達5 mg/dl對免疫比濁法檢測DD影響度均<6%。

　　2.3 線性實驗 各自試劑說明書，免疫比濁法檢測DD線性范圍為200~1 050 ng/ml，選取的高低值標本測得DD含量分別為975 ng/ml、175 ng/ml，計算得回歸方程為y = 0.974x+5.296，相關系數（r）為0.997;膠體金法理論檢測范圍為100~20 000 ng/ml，選取的高低值標本測得DD含量分別為8 000 ng/ml、300 ng/ml，計算得回歸方程為y=0.989x+118.68，相關系數（r）為0.994。結果表明膠體金法至少在300~8 000 ng/ml范圍內仍能保持較好的線性;免疫比濁法線性范圍較小，但可通過自動稀釋樣品檢測高濃度DD。表2 生物干擾物對DD檢測的影響干擾物

　　2.4 比對實驗 將檢測結果作回歸曲線，得到免疫比濁法與膠體金法比對結果的回歸方程：y = 0.3085x + 748.06，相關系數r=0.938。根據CLSI文件要求（r>0.975），可見兩種方法相關性不理想。

　　2.5 兩種方法的DIC診斷效能 129例患者zui終確診為DIC的30例，非DIC 99例。兩種方法診斷DIC的ROC見圖1。曲線下面積分別為0.893（95%可信區間0.836~0.950），0.899 （95%可信區間0.841~0.956）;以DD含量500 ng/ml為診斷閾值，免疫比濁法的診斷敏感度與特異度分別為100%、42.6%，膠體金法分別為96.7%、46.1%。

　　3 討 論

　　臨床對深靜脈血栓（DVT）、肺栓塞（PE）等的早期排查，及對溶血栓治療的動態監測均需要一種對DD快速、準確的定量檢測方法。目前膠體金法與免疫比濁法作為DD定量檢測方法，得到越來越多的應用。膠體金法檢測DD的原理為：加入的樣品中DD分子被包被有DD特異性單克隆抗體的濾過膜吸附，隨后加入DD單克隆抗體與膠體金的偶聯物溶液，膜上的DD與抗體金偶聯物發生三明治型結合反應，并產生顏色變化，此時通過光度計檢測讀數，顏色的強度與樣品中DD含量成正比。免疫比濁法檢測DD的原理為：樣品中DD分子與包被有高特異性DD單克隆抗體的乳膠顆粒結合后，乳膠顆粒發生凝集，此時在405 nm波長下檢測透射光強度變化，凝集程度與樣品中DD含量成正比。兩者均為免疫學方法，保證了較高的檢測特異度。根據上述實驗結果，兩種定量檢測方法均有準確、快速、簡便的特點，尤其免疫比濁法通常由自動化儀器完成檢測，具有更高的檢測靈敏度與精密度，避免了人工加樣的偶然誤差;而膠體金法對設備要求較低，且相對免疫比濁法有更寬的線性范圍。兩種方法對DIC均有*的診斷靈敏度，特異度稍低，適用于對DIC的聯合診斷及排查。比對實驗結果表明，兩種方法相關性不理想，因此不建議一個實驗室同時使用這兩種方法報告DD檢測結果，選擇哪一種DD檢測方法需各實驗室根據自身具體情況決定。