嵌合抗原受體T細胞（CAR T）免疫療法是治療惡性腫瘤的新興手段，抗CD19嵌合抗原受體T細胞（CD19.CAR T）在B細胞惡性腫瘤治療療效顯著，但常伴有免疫效應細胞相關神經毒性綜合征（ICANS）這一不良反應，其臨床特征包括腦病、認知障礙、語言障礙、癲癇發作以及較少見的腦水腫。雖然ICANS致死率低（1%–2%），但其治療需要使用大劑量類固醇和免疫抑制療法，會影響CAR T細胞活性和治療效果，并增加非復發性死亡率。近期，博洛尼亞大學發表題為 “CAR+ extracellular vesicles predict ICANS in patients with B cell lymphomas   treated with CD19-directed CAR T cells”為題的文章，借助3D全自動外泌體熒光檢測分析系統揭示了CAR+細胞外囊泡（CAR+EVs）在預測和理解這種神經毒性反應中的重要作用，為研究者預防和管理CAR T細胞治療的神經毒性反應提供了新的思路，對推動 CAR T 細胞免疫療法安全應用與持續發展意義重大。

文中使用的3D全自動外泌體熒光檢測分析系統是法國Abbelight公司設計研發的，是一款無需純化、可全自動表征分析單個外泌體的創新設備。它能夠提供外泌體粒徑、亞型分布、攜帶蛋白表達及單個外泌體的膜蛋白與生物標志物共定位等信息，操作簡單，結果可靠。設備單分子定位成像技術，可獲得精度高達20 nm的單個外泌體的超分辨成像結果，為該研究提供了關鍵的技術支持。

3D全自動外泌體熒光檢測分析系統

研究者針對100名B細胞淋巴瘤患者開展實驗，為其注射CD19.CAR T細胞，在30天內一共有29人引發了ICANS。患者的血樣結果表明，患有ICANS的患者與未患ICANS的患者的CAR T細胞擴增峰值與30天內的曲線下面積（AUC）無顯著差異，但到達峰值的時間（TTP）更短（圖1），同時CAR_DNA水平到達峰值的時間也更短（圖2），這種動力學上的差異代表著CD19.CAR T細胞更快地到達病灶并激活。

圖1

圖2

先前已有研究指出，CAR   T細胞具備分泌攜帶有CAR的外泌體（EV）的能力。研究者進一步提出假設，認為CAR T血漿外泌體的檢測可以提供CAR T細胞的遷移和功能的信息。首先在含/不含CD19+靶細胞的環境下分別培養了19BBζ.CAR T和19BBζ.eGFP.CAR T細胞。24小時后，收集培養上清并使用包被了CD63，CD81和CD9抗體的玻片捕獲了外泌體，之后使用3D全自動外泌體熒光檢測分析系統進行超分辨成像可以確認在CD19+靶細胞共培養的19BBζ.eGFP.CAR   T細胞上清中含有CAR+EV（圖3A）；單外泌體STORM成像同樣確認在CD19+共培養的19BBζ.CAR T細胞上清中也含有CAR+EV（圖3B&C）；將共聚焦與STORM成像的數據結合，能夠確認19BBζ.CAR T的細胞質中含有大量CAR+EV（圖3D&E）。STORM成像結果的共定位分析可以看出，19BBζ.CAR T和19BBζ.eGFP.CAR T細胞中的大多數外泌體的CD19.CAR蛋白與CD63以單個分子的水平顯示位于同一外泌體上，即兩者共定位（圖3F&G）。以上結果表明，在CD19+靶細胞誘導下，CD19.CAR蛋白以與CD63共定位的CAR+EV的形式大量釋放到了細胞上清中。

圖3 19BBζ.CAR   T與19BBζ.eGFP.CAR T細胞的STORM/共聚焦成像分析

基于細胞實驗結果，研究者對接受了CAR.T治療的患者的血漿進行了流式（圖4左）和STORM檢測（圖4右），在血漿中發現了帶有外泌體和T細胞標記物的CAR+EV。進一步統計分析顯示，后續發病的ICANS患者的day+1的CAR+EV數量（圖5A），CAR+EV的藥代動力學數據（圖5B）及AUC（圖5C），CAR+EV濃度的峰值（圖5E），hour+1和day+1的水平（圖5F）均顯著增高；ROC分析顯示，hour+1時132.8   CAR+EV/μL以上的濃度的預測ICANS發生具有89.29%的靈敏度和74.58%的特異性，day+1時224.5 CAR+EV/μL以上的濃度的預測靈敏度和準確性可達96.55%和 80.36%（圖5G）。

圖4 血漿內CAR+EV的流式和單外泌體成像

圖5 血漿CAR+EV：早期ICANS標記物

在本研究中可以發現，CAR+EV的釋放是CD19.CAR T細胞在體外激活的信號，因為CAR+EV主要在識別靶細胞后釋放。3D全自動外泌體熒光檢測分析系統的STORM成像結果表明，多數CAR+EV上含有標記蛋白CD63，來源于CD19.CAR T細胞的細胞質中預組裝成的富含CD63的顆粒。STORM成像也證實了接受CAR T治療的病人血漿中含有外泌體標記物和CAR蛋白的CAR+EV；由于CD19.CAR   T細胞的激活在ICANS患者中顯著上升，血漿CAR+EV水平可以作為可信的早期ICANS指標。

參考文獻：

[1]. Storci,   G., De Felice, F., Ricci, F., Santi, S., Messelodi, D., Bertuccio, S. N., ... & Bonifazi, F. (2024). CAR+ extracellular vesicles predict ICANS in patients with B cell lymphomas treated with CD19-directed CAR T cells. The Journal of Clinical Investigation, 134(14).