百歐博偉生物：在液相色譜中，給你一個樣品，怎么來選擇流動相將樣品分開呢？在什么情況下使用緩沖溶液呢？緩沖溶液的選擇有什么技術要求？

一、緩沖液的選擇當分離酸性或堿性樣品時，通常需加入一定量的緩沖鹽，緩沖鹽的濃度及類型如何確定？

1、緩沖鹽的濃度緩沖鹽的濃度對離子樣品保留值的影響通常較小，濃度一般為10-50mmol/l。

2、緩沖鹽的類型緩沖鹽類型的選擇，主要取決于所需要的緩沖能力，在反向色譜中，流動相中水相的pH和離子強度在開發對條件微小變化不敏感的耐用方法中非常重要。對于離子型化合物，典型的樣品的保留隨pH改變而明顯變化。

通常在pH2到4條件下，保留時間對pH的微小改變穩定性。因此建議將這一pH范圍作為大多數樣品方法開發的起始pH，包括堿性化合物和一般的弱酸。緩沖鹽溶液的pH值越接近其pka，緩沖能力越強。一般緩沖鹽溶液的pH值應在其pka±1的范圍內。

3、緩沖鹽的離子締合如酸性條件下分離堿性化合物，加入NH4CL，堿性物質離子與反離子相互作用的平衡導致它們相互的溶劑化并形成相關復合物離子：[堿]+[Cl]=[堿+Cl]，在低pH時，堿性化合物被完成質子化，溶液陰離子（如Cl-）在流動相中破壞了堿性物周圍的水分子并增加其疏水性，導致樣品保留時間增加，當鹽濃度大于50mM時，保留時間略有下降，這可能是飽和反離子CI-引起的離子相互作用的屏蔽作用。此外還可以添加硫酸鈉或者高氯酸鈉等改變堿性化合物的保留。

4、緩沖鹽的其它性質緩沖鹽的溶解性、揮發性和穩定性（可能與設備、樣品和或色譜柱發生作用）對某些分離也很重要。如磷酸鹽，在含有高濃度有機相（70%以上），可能會析出；一些緩沖劑放置即降解，貯存或長期使用后其紫外吸收會增加（如：TFA、三乙胺）；一些緩沖鹽能通過形成離子對，對樣品發生作用（如三氟醋酸緩沖劑與陽離子樣品，三乙胺與陰離子樣品等）；揮發性的緩沖鹽如碳酸胺、甲酸銨、醋酸銨等可應用于蒸發光散射、質譜的檢測。

二、峰拖尾常見原因及應對方法

1、HPLC體系中存在過大的死體積，導致一部分的分析物在這些空間里滯留過長的時間而表現為拖尾。這種拖尾是對于每一個色譜峰都存在的，因此當出現每個色譜峰都拖尾時，有可能就是這個原因。以前就遇到過這個問題，儀器增加了一個模塊，死體積增加，峰又胖又拖尾。應對方法：更換更短、內徑更小的管路；檢查部件的連接是否緊密；檢查保護柱或者在線過濾器的安裝是否合適（這個尤為常見）；換到表現正常的儀器排查下是否是色譜柱的原因等。

2、在HPLC柱中存在兩種或以上的吸附位點，這兩個位點與分析物作用的非均一性。有的固定相表面存在大量低能量吸附位點，這種吸附位點與分析物的作用是非選擇性的，包括色散或者簡單的極性作用。有的固定相表面同時存在少量的高能吸附位點，這種吸附位點與分析物的作用是有選擇性或者特異性的，包括氫鍵作用、離子交換作用和螯合作用等，不同吸附位點作用力不同導致峰拖尾。應對方法：通過改變流動相條件（如添加劑，pH值等）或者針對性地更換色譜柱來減少拖尾。

3、色譜柱過載。當樣品進樣量過大，使色譜柱出現過載時，色譜峰也會表現出拖尾。特別是帶電荷的化合物時，當保留在固定相上時會因為靜電排斥而大大降低其載樣量。應對方法：可以通過降低進樣量觀察峰形是否改善來確定是否是過載導致的峰拖尾。對于由于帶電荷的化合物，可以通過調節pH值（比如把化合物調至中性狀態）或者加入離子對試劑來改善峰形。

4、色譜柱柱頭污染或篩板部分堵塞。這樣導致分析物分子中的一部分滯留時間增加從而導致拖尾。應對方法：這種情況一般表現為色譜圖的所有色譜峰都出現拖尾，可以通過更換同款色譜柱來排查或者反接色譜柱（如果確定色譜柱可以反接）觀察峰形是否改善來判斷。

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