一、引言

二、材料與方法

（一）臍帶間充質干細胞的分離與培養

1. 采集新鮮的臍帶組織，在無菌條件下將其浸泡于含有抗生素（如青霉素 - 鏈霉素混合液）的平衡鹽溶液中，充分清洗以去除血跡及雜質。

2. 運用組織塊貼壁法，將臍帶組織剪成小段，均勻貼附于培養皿底部，加入含特定比例胎牛血清（如 10% - 20%）、谷氨酰胺以及生長因子（如堿性成纖維細胞生長因子 bFGF）的低糖 DMEM 培養基，置于 37°C、5% CO?培養箱中培養。

3. 定期觀察細胞生長狀況，待細胞融合度達到約 80% - 90% 時進行傳代培養，選取第 3 - 5 代細胞用于后續實驗。

（二）電穿孔轉染實驗設計

1. 轉染質粒的準備：提取并純化攜帶特定報告基因（如綠色熒光蛋白 GFP 或熒光素酶基因）的質粒，使用紫外分光光度計測定其濃度和純度，確保質量符合轉染要求。

2. 電穿孔緩沖液的選擇：比較不同商業電穿孔緩沖液（如 Opti-MEM、RPMI 等）對轉染效果的影響，選擇最適緩沖液用于后續實驗。

3. 電穿孔參數的設置：設置多組不同的電壓（如 100V - 300V）、脈沖時間（如 5ms - 50ms）、脈沖次數（如 1 - 5 次）組合，每組參數設置至少 3 個重復樣本。

（三）電穿孔轉染操作過程

1. 收集處于對數生長期的 UC-MSCs，用預冷的電穿孔緩沖液重懸細胞，調整細胞密度至合適范圍（如 1×10? - 5×10? 個 /ml）。

2. 將一定量（如 1μg - 10μg）的質粒 DNA 與細胞懸液輕輕混勻，轉移至電穿孔 cuvette 中，避免產生氣泡。

3. 將電穿孔 cuvette 置于電穿孔儀中，按照設定的參數進行電穿孔操作。電穿孔結束后，立即將細胞轉移至預熱的完整培養基中，輕輕混勻后接種于培養板中，置于 37°C、5% CO?培養箱中繼續培養。

（四）轉染效率檢測

1. 在轉染后特定時間點（如 24 - 72 小時），使用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達情況，隨機選取多個視野，拍攝照片并統計綠色熒光陽性細胞的比例，以此作為轉染效率的直觀指標。

2. 對于攜帶熒光素酶基因的質粒轉染，采用熒光素酶檢測試劑盒，在化學發光檢測儀上測定細胞裂解液中的熒光素酶活性，根據標準曲線計算轉染效率。

（五）細胞活性檢測

1. 采用臺盼藍拒染法，在轉染后不同時間點（如 6 小時、24 小時、48 小時）取少量細胞懸液，與臺盼藍溶液按一定比例混合，在顯微鏡下觀察未被染成藍色的活細胞數量，計算細胞活率。

2. 運用 MTT 法，在相應時間點向細胞培養孔中加入 MTT 溶液（終濃度為 0.5mg/ml），繼續培養 4 小時后，吸去上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）溶解形成的紫色結晶物，使用酶標儀在 570nm 波長處測量吸光度值，根據吸光度值評估細胞活性。

三、結果

（一）不同電穿孔參數對轉染效率的影響

1. 電壓的影響：隨著電壓的升高，轉染效率呈現先上升后下降的趨勢。在較低電壓（如 100V - 150V）范圍內，轉染效率較低，隨著電壓增加到一定值（如 200V - 250V），轉染效率顯著提高，達到峰值。當電壓進一步升高（如超過 250V）時，由于細胞受到過度電擊損傷，轉染效率開始下降。

2. 脈沖時間的影響：脈沖時間對轉染效率也有類似的影響規律。較短脈沖時間（如 5ms - 10ms）時轉染效率較低，隨著脈沖時間延長（如 20ms - 30ms），轉染效率逐漸增加，但當脈沖時間過長（如超過 30ms）時，細胞損傷加劇，轉染效率降低。

3. 脈沖次數的影響：增加脈沖次數在一定程度上能夠提高轉染效率，但當脈沖次數超過 3 次時，細胞活性明顯下降，且轉染效率的提升幅度逐漸減小。

（二）不同電穿孔參數對細胞活性的影響

1. 高電壓（如超過 250V）和長脈沖時間（如超過 30ms）均會導致細胞活性顯著降低，表現為臺盼藍拒染法檢測的活細胞比例減少，MTT 法測定的吸光度值下降。

2. 過多的脈沖次數（如大于 3 次）也會對細胞活性產生不利影響，使細胞在轉染后出現大量死亡或增殖受抑制的現象。

（三）合適電穿孔轉染條件的確定

四、討論