自2012年亮相以來，CRISPR技術已在基因功能研究、藥物靶點篩選、遺傳疾病治療、癌癥研究以及作物育種等多個領域取得突破性成果。其工作機制如下：

Cas蛋白（例如廣泛使用的Cas9）在向導RNA（gRNA）的引導下能夠精準地定位到特定的DNA序列上。一旦到達目標位置，Cas9會與DNA結合并切割其雙鏈，從而產生一個雙鏈斷裂（DSB）。面對這樣的損傷，細胞會激活自身的修復機制來應對，主要包括非同源末端連接（NHEJ）或同源重組修復（HDR）兩種方式。利用這些天然存在的DNA修復過程，科學家可以在目標DNA位點引入所需的特定序列變化，實現對基因組的精確編輯。

目前CRISPR技術能的精確度對DNA進行修改，包括添加、刪除或替換特定基因片段，這一進步不僅使基因修復更加便捷和精準，也為基因治療、生物育種、合成生物學等指明了新的發展方向。

針對上述基因編輯技術流程，翌圣生物可提供高品質Cas蛋白等相關產品，以及蛋白改造、GMP規?；a定制服務。這些產品覆蓋了從設計到實施的整個過程，旨在幫助研究人員更高效、更準確地完成基因編輯實驗。接下來，小編將選取部分重點產品給大家進行展示。

圖1. 不同時間的sgRNA的合成量

• 適用范圍廣：不同種類的sgRNA均可獲得高產量

圖2. 不同序列的sgRNA的合成產量

圖3. 合成的sgRNA的純度（安捷倫2100測定）

圖4. sgRNA的剪切效率效果圖

Cas9 Nuclease來源于野生型釀膿鏈球菌S. pyogenes，是依賴RNA介導的內切核酸酶，可以特異地切割雙鏈DNA（在DNA PAM存在的情況下，也可以切割單鏈DNA或單鏈RNA）。Cas9切割位點位于目標序列（target sequence）內，離PAM（NGG）區3個堿基。本產品經過密碼子優化及核定位信號（NLS）設計，由大腸桿菌重組表達而來，編輯效率高，可用于細胞（造血干細胞、T細胞等）的基因修飾，也可用于分子診斷，檢測病原體等。

A：體外切割測試：3批次體外切割活性均達98%以上。

B：體內基因敲除，敲除效率與進口品牌一致。

圖5. Cas9 Nuclease體外切割活性及基因敲除效率結果

NLS-Cas9-EGFP在Cas9核酸酶的基礎上進行改造，它在N端包含一個核定位信號NLS，在C端包含一個EGFP和一個6X (His)序列，Cas9 RNP復合物在進入細胞后可立即定位到細胞核。此外，與其他系統相比，EGFP標簽可作為追蹤或分類轉染細胞的報告器，通過熒光激活細胞分選(FACS)富集所需基因組編輯的細胞群。它大大降低了在基因組編輯應用中與單細胞克隆和基因分型相關的人工和成本。

A：細胞轉染實驗：電穿孔后12 h，在熒光顯微鏡下觀察細胞。

B：切割效率檢測：線性化質粒的消化效率大于90%。

注：20 μL的反應體系，在含有線性化質粒、gRNA 和Cas9的1×Cas9核酸酶反應緩沖液中在37°C下反應1小時，在瓊脂糖凝膠電泳測定結果顯示，線性化質粒的消化效率大于90%。

圖6. NLS-Cas9-EGFP Nuclease細胞轉染及體外切割結果

ArCas12a核酸內切酶，源自Agathobacter rectalis細菌的CRISPR系統，別名Cpf1，是一個包含1263個氨基酸的單體蛋白。Cas12a缺乏HNH結構域，可單獨利用其RuvC結構域在CRISPR RNA（crRNA）引導下識別位于靶標核酸5’端富含胸腺嘧啶（T）的PAM區而啟動對靶標DNA的切割，已成功用于許多哺乳動物和植物的基因組編輯。此外Cas12a還具有反式切割活性，可不加選擇地切割反應體系中的非靶標單鏈DNA。與LbCas12a/AsCas12a相比，ArCas12a具有更高的溫度適應性（25-55℃），可適用于基因組編輯及核酸檢測等。

• 雙鏈DNA高效體外切割

圖7. ArCas12a順式切割活性檢測 M：Marker；C：模板雙鏈DNA。

注：在crRNA的引導下可高效的切割雙鏈DNA（600 bp）產生兩段切割產物（200 bp+400 bp）

圖8. ArCas12a反式切割活性檢測

注：以雙鏈DNA模板為靶標，加入ArCas12a、crRNA（存在與模板DNA序列互補的spacer區）及單鏈DNA報告探針（含有熒光報告基團）進行體外切割，當ArCas12a與crRNA及靶標DNA形成復合體后會激活反式切割活性，切割單鏈DNA報告探針，從而發出熒光。結果顯示，翌圣ArCas12a與crRNA及模板DNA形成復合體后具有反式切割活性，可剪切單鏈DNA。

AapCas12b核酸酶（又名C2c1）是由tracrRNA:crRNA（或sgRNA）介導的DNA核酸內切酶，來源于嗜酸耐熱菌Alicyclobacillus acidophilus，在靶標雙鏈DNA存在PAM（TTN）序列的情況下，特異地剪切靶標雙鏈DNA，使DNA雙鏈斷裂并生成粘性末端。AapCas12b可不依賴PAM序列特異地剪切單鏈DNA靶標。雙鏈或單鏈DNA靶標均能激活AapCas12b的反式剪切活性（即旁路剪切活性/附屬剪切活性），即當AapCas12b酶與sgRNA、靶標DNA結合形成三元復合物后，便會被激活針對非特異序列ssDNA的反式剪切活性，將體系中的任意序列ssDNA切碎。AapCas12b最佳剪切反應溫度為60℃，比AacCas12b更耐高溫，適用于與LAMP聯用，開發恒溫擴增/CRISPR-Cas檢測體系。

• 順勢切割活性：效果媲美進口品牌T*

圖9. AapCas12b Nuclease (10 μM) (Cat#14808ES)順式切割活性驗證

注：在20 μL的反應體系，含有帶PMA序列的雙鏈Target DNA、sgRNA、Cas12b和1×reaction buffer，在60°C下反應30 min，85°C下滅活5 min，在瓊脂糖凝膠電泳測定結果顯示，三批次AapCas12b Nuclease (10 μM) (Cat#14808ES)均能有效切割雙鏈Target DNA,切割效果與進口品牌T*相當。

圖10. AapCas12b Nuclease (10 μM) (Cat#14808ES)反式切割活性驗證

注：在20 μL的反應體系，含有帶PMA序列的雙鏈Target DNA、sgRNA、Cas12b、Report ssDNA熒光探針和1×reaction buffer，在60℃反應1h，每30 sec采集一次熒光信號，結果顯示在Target DNA、sgRNA、Cas12b共同存在的情況下，Report ssDNA熒光探針能被切割，從而釋放熒光信號。

當前，CRISPR基因編輯技術正處于快速發展的時期，整個領域仍在不斷成熟和完善中。隨著科學研究和技術應用的持續推進，我們有理由相信未來將涌現出更多創新性的基因編輯工具，這些新工具將進一步拓寬該技術的應用場景與潛力。

如果您對基因編輯有任何需求或興趣，歡迎隨時聯系我們。無論是在基礎研究、藥物開發、農業生物技術、合成生物學等領域，我們都致力于為您提供的技術支持和服務，共同探索基因編輯帶來的無限可能。