一、引言

二、材料與方法

（一）實驗材料

1. 綿羊卵巢采集自當地屠宰場，離體 2 小時內送達實驗室，于預冷生理鹽水中保存，用于卵母細胞采集。

2. 細胞系選用綿羊成纖維細胞，由實驗室前期分離培養并凍存，復蘇后傳代至對數生長期用于實驗。

3. 白藜蘆醇、褪黑素標準品購自藥企，純度超 98%，以二甲基亞砜（DMSO）配制成母液，工作液現用現配，確保 DMSO 終濃度低于 0.1%，排除其干擾。

（二）實驗分組

1. 細胞實驗分對照組、白藜蘆醇低劑量組（1 μmol/L）、白藜蘆醇高劑量組（10 μmol/L）、褪黑素低劑量組（100 nmol/L）、褪黑素高劑量組（1 μmol/L）及聯合用藥組（白藜蘆醇 1 μmol/L + 褪黑素 100 nmol/L），每組設 6 個復孔。

2. 卵母細胞實驗依相同劑量梯度分組，每組至少 30 枚卵母細胞，重復 3 次，確保樣本代表性。

（三）實驗流程

1. 細胞處理：將綿羊成纖維細胞接種于 96 孔板，培養 24 小時貼壁后換液，分別加入含不同藥物濃度培養基，孵育特定時長（24、48、72 小時），對應時間點檢測細胞活性、氧化應激指標等。

2. 卵母細胞操作：采用機械法結合酶解法獲取卵丘 - 卵母細胞復合體，經體外成熟培養體系預平衡后，加入藥物處理，培養 24 小時觀察成熟率，后續行孤雌激活評估早期胚胎發育潛能，記錄卵裂、囊胚形成數據。

（四）檢測指標

1. 細胞活性以 CCK - 8 法測定，吸光度值間接反映存活細胞數量；細胞凋亡借 Annexin V - FITC/PI 雙染流式細胞術分析，精準量化凋亡比例；活性氧（ROS）水平用 DCFH - DA 熒光探針標記，熒光強度與 ROS 呈正相關。

2. 卵母細胞成熟依第一極體排出判定，成熟率 = 排出第一極體卵母細胞數 / 總卵母細胞數 ×100%；胚胎發育潛能觀察卵裂期胚胎數量及囊胚形成率，囊胚率 = 囊胚數 / 卵裂胚胎數 ×100%。

三、結果

（一）細胞層面

1. 細胞活性：與對照組相較，白藜蘆醇及褪黑素各劑量組處理 48 小時后顯著提升綿羊成纖維細胞活性（P < 0.05），聯合用藥組增幅尤為突出，高劑量白藜蘆醇單藥效果次之，表明二者具協同促增殖潛能。

2. 抗氧化能力：藥物處理組 ROS 水平呈劑量依賴性降低，褪黑素高劑量組 72 小時降幅達 45%，白藜蘆醇組亦有效抑制氧化應激，聯合組 ROS 清除效率超 60%，同時抗氧化酶（SOD、CAT）活性增強，維持細胞氧化還原穩態。

3. 抗凋亡表現：流式結果顯示，處理組凋亡細胞比率顯著減少，白藜蘆醇通過激活 PI3K/Akt 通路抑制線粒體途徑凋亡，褪黑素則上調抗凋亡蛋白 Bcl - 2，聯合用藥近乎消除早期凋亡峰，全方面守護細胞存活。

（二）卵母細胞層面

1. 體外成熟：白藜蘆醇與褪黑素顯著加速卵母細胞成熟進程，高劑量組成熟率較對照組提升約 18%（P < 0.05），聯合用藥使成熟時間提前約 2 小時，皮質顆粒分布更均勻，預示受精能力增強。

2. 胚胎發育：經孤雌激活，處理組卵裂率及囊胚率大幅改善，褪黑素助力早期卵裂，白藜蘆醇促進囊胚形成及內細胞團增殖，聯合組囊胚發育至孵化階段比例明顯增加，胚胎質量顯著優化，為后續胚胎移植奠基。

四、討論

五、結論