Mechanical stress protects against chondrocyte pyroptosis through TGF-β1-mediated activation of Smad2/3 and inhibition of the NF-κB signaling pathway in an osteoarthritis model

Keywords: Chondrocyte; Exercise therapy; Mechanical stimulation; Osteoarthritis; Pyroptosis; TGF-β1.

骨關節炎（OA）是一種常見的慢性關節疾病。研究學者推薦 OA 患者進行運動作為非藥物治療手段。運動提供的機械力是軟骨穩態的關鍵因素，包括軟骨細胞表型、炎癥反應和合成代謝-分解代謝平衡。盡管運動療法得到了解剖學特征的支持，但關于運動計劃的推薦持續時間和強度，以及它們對 OA 提供保護的潛在機制一直存在爭議。

細胞焦亡是一種促炎性的程序性細胞死亡過程，被認為與 OA 軟骨中存在空腔隙和細胞減少有關。一些研究已闡明了靶向焦亡以抑制或逆轉 OA 的治療意義。因此，有理由推測類似的細胞焦亡抑制可應用于 OA 的運動療法。

TGF-β1 是 TGF-β 超家族的一種亞型。低水平的 TGF-β1 可能導致軟骨退變，TGF-β1 通路的激活對于在 OA 進展期間維持軟骨完整性至關重要。相反，過度的 TGF-β1 信號會加劇軟骨和骨骼中的 OA 樣表型。最近的一項研究證實，血漿中的 TGF-β1 在運動后達到峰值，并在 1 小時內恢復到基線水平。這可能表明機械應力促進了 TGF-β1 的內源性產生。因此，調整運動強度，使軟骨細胞中的 TGF-β1處于適當濃度，對于治療 OA 是值得的。

據此，中國醫科大學附屬盛京醫院超聲科、急診科及骨外科的研究團隊推測 TGF-β1 在 OA 治療中充當運動和細胞焦亡之間的中繼站，并進行了深入研究，旨在探討細胞焦亡在 OA 運動療法中的作用，以及 TGF-β1 誘導的其調節機制。研究成果發表在 Biomedicine & Pharmacotherapy 期刊題為“Mechanical stress protects against chondrocyte pyroptosis through TGF-β1-mediated activation of Smad2/3 and inhibition of the NF-κB signaling pathway in an osteoarthritis model”。該研究為 TGF-β1 在 OA 發病機制中的作用提供了見解，并為 OA 患者提供了合適的運動計劃。

首先，基于GEO公共數據庫對正常軟骨樣本和 OA 軟骨樣本GSE57218數據集進行分析。與正常樣本相比，OA 軟骨中分別有大約 359 個和 357 個基因上調和下調。一些差異表達基因（DEGs），包括 TGF-β 家族成員，具有強烈的顯著差異。與對照組相比，OA 組的 TGF-β1 表達略有降低，這促使研究人員繼續探索機械應力是否可以內源性地恢復 OA 軟骨中 TGF-β1 表達的降低。

因此，實驗繼續驗證 TGF-β1 與 OA 之間的關聯。通過 X 射線成像觀察到骨贅增生或關節間隙狹窄等 OA 特征（圖1 A）。軟骨樣本分為未受損（U）和受損（D）區域，H&E染色和甲苯胺藍染色顯示受損區域的 OARSI 評分顯著升高（圖1 B）。此外，TGF-β1 表達的變化與膠原蛋白II 的變化一致，在受損區域顯著低于未受損區域（圖1 C）。

圖1    與 OA 患者關節軟骨未受損區域的 TGF-β1 表達相比，受損區域的表達下調。（A）OA 患者的 X 射線照片。（B）OARSI 評分的 OA 患者受損和未受損區域的 H&E 和甲苯胺藍染色。（C）1-3 號患者軟骨中膠原蛋白II 和 TGF-β1 的蛋白質印跡分析。柱狀圖顯示了所有 8 名患者的統計數據。

接下來，對OA患者的軟骨細胞進行不同濃度 TGF-β1（0、0.5、1、2、16 ng/mL）和不同強度循環拉伸應力（CTS，4%、6%、8%、10%，0.5 Hz，12 h）干預。結果表明，TGF-β1 顯著增加細胞內膠原蛋白II 的水平，尤其是在 4 ng/mL 濃度時。然而，與 4 ng/mL 相比，高濃度的 TGF-β1 逆轉了這種作用。此外，8% 強度的 CTS 會增加膠原蛋白II 的水平，且TGF-β1 水平也隨著 CTS 強度的增加而升高。值得注意的是，在 6%、8% 和10% 強度下，TGF-β1 水平與對照組有統計學差異。用 10 μM RepSox（TGFβ R-1抑制劑）抑制 TGF-β1 后，無論是否進行 CTS 處理，膠原蛋白II 的水平都會顯著降低。這表明。CTS 通過增加 TGF-β1 來拯救OA 過程中的軟骨細胞。

CTS 顯著降低細胞焦亡相關標志物 NLRP3、pro-caspase、caspase 1、IL-1β 和 GSDMD-N水平，而 TGF-RI、Smad2、Smad3 和 IκB 顯著升高（圖2 A）。這些趨勢在用 RepSox 處理后發生了逆轉，然而，IκB 的結果卻相反。

TGF-β1是NF-κB通路的上游調控因子，因此，實驗探索了 NF-κB 通路（圖2 B）。用 10 μM SIS3 阻斷 Smad 通路后，觀察到 TGF-β1 降低了細胞核中的 NF-κB p65。免疫熒光染色描繪了 NF-κB 和 Smad 2 的亞細胞定位（圖2 C、D）。在用 CTS 處理軟骨細胞期間觀察到 NF-κB 的核易位，同時Smad2 的核易位被激活。CTS 減弱了 ROS 在軟骨細胞中的積累以緩解氧化應激，這可以通過 RepSox 阻斷 TGF-β1 來逆轉（圖2 E）。TEM 圖像表明 CTS（8%，0.5 Hz，12 h） 可以改善 OA 患者軟骨細胞的細胞形態，如細胞腫脹、細胞膜突出和細胞核皺縮（圖2 F）。NLRP3 抑制劑 MCC950 和 CTS 在增加軟骨細胞膠原蛋白II 方面顯示出相似的作用，這表明MCC950 可以減輕 OA。此外，SYTOX 染色顯示 CTS 通過 TGF-β1 減少軟骨細胞死亡，這可能暗示細胞焦亡受到抑制（圖2 G）。總之，這些數據表明，CTS 通過 TGF-β1 協調激活 Smad2/3 并抑制 NF-κB 信號保護 OA 軟骨細胞免于焦亡。

圖2     在 CTS 處理中，升高的 TGF-β1 激活 Smad2/3 并抑制 NF-κB 核易位以抑制軟骨細胞焦亡。（A）CTS 和 10 μM RepSox 處理抑制 TGF-β1 下 NLRP3、TGF-β R I、Smad2、Smad3、pro-caspase-1、caspase-1、IκB-α、IL-1β 和 GSDMD-N 的蛋白質印跡分析。（B）4 ng/mL TGF-β1 和 10 μM SIS3 處理以抑制 Smad 通路下細胞質中 IκB-α、IL-1β 和 NLRP3 以及細胞核中 NF-κB p65 的蛋白質印跡分析。（C、D）NF-κB p65 和 Smad 2 的核易位。（E）軟骨細胞中的 ROS 熒光顯微鏡和流式細胞術。（F）軟骨細胞的TEM。（G）軟骨細胞的 SYTOX 綠染色。

最后，研究人員通過關節注射碘乙酸鈉（MIA）建立了大鼠膝關節 OA 模型，并進行了不同強度的跑步機鍛煉（圖3 A）。OAG 大鼠的 Mankin 和 OARSI 評分顯著升高（圖3 B、C）。跑步機運動在中等強度下達到最佳治療效果，然而，根據改良的 Mankin 評分和 OARSI 評分，高強度運動加劇了OA 進展（圖3 B、C）。此外，RepSox 對 TGF-β 1 的抑制逆轉了中等跑步機運動的治療效果（圖3 B、C）。圖3 D的軟骨變化與圖3 F的H&E染色和甲苯胺藍染色一致。OAM組比OAL和OAH組軟骨表面更光滑，軟骨陷窩更豐富，療效最好。X 射線成像和計算機斷層掃描也表明適度的跑步機運動緩解了關節間隙狹窄、骨贅增生和軟骨下囊腫（圖3 E、G）。

此外，關節內灌洗液（IALF）中 TNF-α 和 IL-1β 水平的變化與血清中相似，且在 OAM 大鼠中觀察到較低濃度。OAM 大鼠中觀察到最佳治療效果，膠原蛋白II 和 TGF-β 1 顯著增加，NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1 和 IL-1β 顯著降低。這表明，中等強度跑步機運動通過 TGF-β1 抑制細胞焦亡，發揮軟骨保護作用。

圖3    中等強度跑步機運動在大鼠膝關節 OA 模型中通過 TGF-β1 發揮最佳抗 OA 作用。（A） 動物實驗設計（10 只大鼠/組）。實驗組：CG = 對照組；OAG = 注射 MIA 的 OA 組；OAL = OAG 進行低強度跑步機鍛煉（15.2 m/min with 0° of inclination，60 min/day，5 days/week for 4 weeks）；OAM = OAG 進行中等強度的跑步機鍛煉（19.3 m/min with 5° of inclination，60 min/day，5 days/week for 4 weeks）；OAH = OAG 進行高強度跑步機鍛煉（19.3 m/min with 5° of inclination，60 min/day，5 days/week for 4 weeks）；OAM + RepSox = OAM 與 RepSox 干預。（B）改良的 Mankin 分數，+aP = 0.024。（C）OARSI 分數。（D）大鼠膝關節的大體成像。（E）大鼠膝關節的 X 射線成像。（F）大鼠膝關節的 H&E 和甲苯胺藍染色。（G）大鼠膝關節的計算機斷層掃描成像。

圖4     圖形概要

機械應力通過增加 TGF-β 1 抑制軟骨細胞焦亡的相關分子機制。機械應力通過 TGF-β1 對 Smad2/3 的協調激活和對 NF-κB 信號通路的抑制來防止焦亡。運動誘導的 TGF-β1 升高與細胞膜上的 TGF-β1 I 型受體（TGF-β1 R1）結合。一方面，這個過程促進了 Smad2/3 的募集，導致 Smad2/3/4 復合物的形成。磷酸化的 Smad2/3/4 可以易位到細胞核。然而，TGF-β1 R1 的激活抑制了NF-κB-p65-IκBα 復合物中 NF-κB p65 的釋放，從而誘導 NF-κB p65 的核易位。在細胞核中，Smad2/3/4 磷酸化的增加和 NF-κB p65 表達的降低通過調節下游基因的表達來抑制焦亡。

總之，該研究表明， OA 中中等強度的機械負荷保護軟骨細胞免受焦亡。機械刺激強度不當可能會加重體外和體內的 OA。此外，TGF-β 1 的升高是機械刺激依賴性的，并對軟骨細胞焦亡產生抑制作用。過量的內源性 TGF-β1 可能是不適當的運動誘導的 OA 進展的潛在原因。運動誘導的 TGF-β1 協調激活 Smad2/3 并抑制 NF-κB 信號通路以抑制 OA 中的焦亡。因此，這項研究為開發安全有效的 OA 運動療法提供了理論框架。

參考文獻：Wang Y, Jin Z, Jia S, Shen P, Yang Y, Huang Y. Mechanical stress protects against chondrocyte pyroptosis through TGF-β1-mediated activation of Smad2/3 and inhibition of the NF-κB signaling pathway in an osteoarthritis model. Biomed Pharmacother. 2023 Mar;159:114216. doi: 10.1016/j.biopha.2023.114216. Epub 2023 Jan 11. PMID: 36634591.

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