H1人胚胎干細胞培養(yǎng)準備

一.試劑準備

1)hESC/iPSC培養(yǎng)基配制(500 mL)

1. 在4條件下解凍hESC/iPSC Grouth Supplements A/B，勿在37培養(yǎng)箱/水浴鍋解凍。

2. 參考表1在生物安全柜中，使用無菌移液管混勻下列成分配制成hESC/iPSC培養(yǎng)基，之后置于4儲存，封口膜封好后2周內(nèi)使用。

3. 有初培養(yǎng)需擴建的需求，建議先配置100 mL,保證2周內(nèi)使用完畢。

2)Matrigel鋪板(以貨號為354277的Corning Matrigel包被6孔板為例)

A. 分裝 Matrigel

1. 貨號354277的Matrigel，操作說明中不標注蛋白濃度，而是以Dilution Factor表示，如某批次的推薦Dilution Factor為278 μL，則表明278 μL可包被4塊6孔板，分裝數(shù)量=5 mL /0.278=17.98。

2. 準備18個無菌1.5 mL EP管，標記Matrigel日期、操作人;1mL無菌吸頭;EP管架，均置于-20冰箱中預(yù)冷1小時。

3. 將Matrigel放置4冰箱過夜解凍，當Matrigel解凍即可開始分裝。

注：在解凍時，將Matrigel放置冰箱內(nèi)側(cè)角落，切勿放在靠近冰箱門附近。

4. 準備一個裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的Matrigel、預(yù)冷的1.5 mL EP管及EP管架、1mL吸頭放置于生物安全柜上。

5. 混勻Matrigel，無菌分裝于各個1.5 mL EP管中，并置于冰上。當吸頭被堵塞可能導(dǎo)致分裝體積不準時需要更換吸頭。

6. 將分裝后的 Matrigel 置于-20冰箱中保存。

B. 鋪板

1. 取36 mL冷藏DMEM/F12于50 mL離心管中，準備4個6孔板，標記Matrigel、批號、日期和操作人。

2. 1 mL無菌吸頭置于-20冰箱中預(yù)冷1小時，取出一支冷凍的Matrigel(5mL)置于4冰箱解凍至化凍。

3. 準備一個裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的Matrigel、預(yù)冷的1mL吸頭放置于生物安全柜上。

4. 用預(yù)冷吸頭向解凍過的Matrigel(5mL)加入1 mL冷的DMEM/F12并反復(fù)吹打解凍混勻。

5. 吸出已解凍混勻的Matrigel加入離心管中剩余的DMEM/F12，使用10 mL移液管再次反復(fù)吹打混勻。

6. 分裝1.5 mL/孔于4個六孔板中，輕輕搖晃混勻。

7. 培養(yǎng)板置于室溫1小時后即可使用，或置于4冷藏過夜，兩周內(nèi)使用。

H1人胚胎干細胞培養(yǎng)操作

1)H1人胚胎干細胞復(fù)蘇步驟(以6孔板為例)

1. 將水浴鍋預(yù)熱至37；并將Matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時恢復(fù)至室溫(15~30)。

2. 取4 mL hESC/iPSC培養(yǎng)基，按照1:4000比例加入1 μL的hESC/iPSC Supplement C，恢復(fù)至室溫(15~30)。

注意：不要在37水浴鍋中預(yù)溫培養(yǎng)基。

3. 取出1支冷凍的細胞置于37水浴鍋手持輕輕搖晃，2 min內(nèi)解凍，肉眼觀察細胞懸液內(nèi)冰晶即將消失時取出。

4. 75%酒精無塵紙擦拭凍存管表面，轉(zhuǎn)入生物安全柜;將細胞懸液移到事先準備好的15 mL 離心管中，隨后緩慢逐滴加入10mL DMEM/F12，過程中輕柔晃動混勻細胞，160g離心5 min。

5. 吸棄上清，加入預(yù)溫的4 mL的hESC/iPSC培養(yǎng)基+hESC/iPSC Supplement C制備細胞懸液，盡量避免吹打。

注：可留20 μL上清液，輕彈管底，使細胞懸浮液更均勻，避免成較大細胞團。

6. 吸除6孔板中2孔的Matrigel包被液，將細胞懸液按照2 mL/孔接種到1個孔中。

7 水平十字搖勻三次，置于37，5% CO2濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中，再次水平十字搖勻三次培養(yǎng)。

8. 18-24小時后換新的hESC/iPSC培養(yǎng)基，之后每天更換培養(yǎng)基。

注：在hESC(H1)培養(yǎng)過程中，如果細胞的匯合度超過50%，建議更換培養(yǎng)基時，培養(yǎng)基的體積增加至3-4mL/孔。

培養(yǎng)容器(孔數(shù))底面積DPBS (mL)EDTA傳代工作液hPSC培養(yǎng)基*

2)H1人胚胎干細胞傳代步驟(以6孔板為例)

1. 傳代條件：① H1人胚胎干細胞匯合度達85%左右(如圖1(C-D)所示)，一般情況下每3-4天傳代;

② H1人胚胎干細胞匯合度較低，生長密度分布不均勻。

注：即使克隆團較小、匯合度不足，也建議不要連續(xù)培養(yǎng)超過5天。

2. 傳代比例：可根據(jù)細胞生長狀態(tài)和實驗需要按1:5~1:12的比例進行傳代，如果細胞正常，克隆團匯合度85%，大小均勻(如圖1(C-D)所示)，建議按照1:8進行傳代，如果密度偏低，則可降低傳代比例;密度偏高，則增加傳代比例。

注：1:8傳代就是1個孔瓶傳8個孔(以6孔板為例)。

3. 將 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時恢復(fù)至室溫(~25)。

4. 根據(jù)傳代接種的孔數(shù)準備2 mL/孔的hESC/iPSC培養(yǎng)基，并按1：4000比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢復(fù)至室溫(~25)。

5. 將 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時恢復(fù)至室溫(~25)。

6. 根據(jù)傳代接種的孔數(shù)準備2 mL/孔的hESC/iPSC培養(yǎng)基，并按1：4000比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢復(fù)至室溫(~25)。

7. 將孔內(nèi)培養(yǎng)基吸取，加入2 mL/孔的DPBS(不含鈣鎂)，輕輕搖晃并吸取。

8. 加入2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution使溶液覆蓋孔底。

9. 置于37培養(yǎng)箱中孵育8-9 min。

注：① 消化8-9 min后鏡下觀察細胞變化，當大部分細胞變亮變圓，且細胞尚未脫離基質(zhì)或漂起時即可終止消化，若大部分細胞仍未變亮，則需要延長消化時間;

② 保持6孔板與培養(yǎng)箱金屬隔板直接接觸，使6孔板受熱均勻，不要疊放。

10. 消化結(jié)束后輕輕地將細胞培養(yǎng)板拿回生物安全柜，避免震蕩搖晃細胞，傾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。

11. 及時加入2 mL/孔預(yù)溫的hESC/iPSC培養(yǎng)基+ hESC/iPSC Supplement C，水平十字搖晃6孔板使細胞脫離基質(zhì)。

注：① 加hESC/iPSC培養(yǎng)基 + hESC/iPSC Supplement C時，可輕柔吹打細胞1-2次，不能超過2次，避免反復(fù)吹打；有部分細胞(10%～15%)未脫離基質(zhì)是正常現(xiàn)象，若有大量細胞未脫離則需延長消化時間(< 10min)。

②hESC(H1)細胞不能長時間處于hESC/iPSC Passage Solution(<15 min)，所以收集接種細胞時操作必須快速,以及最好一次操作不要超過4孔(六孔板)。

12. 吸取6孔板中的Matrigel溶液，加入預(yù)溫的hESC/iPSC培養(yǎng)基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔。

13. 在6孔板上標記細胞名稱、代次、傳代比例、日期、操作人。將步驟9獲得的細胞懸液輕輕搖勻，按預(yù)先設(shè)定的傳代比例均勻分配于孔板中。

注：為了鋪板均勻并降低對細胞的損傷，可以將步驟9獲得的細胞懸液收集至2mL離心管，輕柔顛倒混勻細胞1-2次;再按照傳代比例接種。

14. 接種后，水平十字搖勻6孔板三次，置于37，5% CO2濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中， 再次水平十字搖勻6孔板三次，培養(yǎng)過夜。

15. 18-24小時后更換新hESC/iPSC培養(yǎng)基，此后每天換液，4-5天后繼續(xù)傳代/凍存。

3)H1人胚胎干細胞凍存步驟(以6孔板為例)

1. 當H1人胚胎干細胞匯合度達85%左右(如圖1(C-D)所示)可收獲凍存，一般6孔板每孔可凍存1管。

2. 準備相應(yīng)數(shù)量的1.5/2 mL凍存管，標記細胞名稱、代次(P#)、日期、操作人。

3. 取出4冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，置于室溫預(yù)溫，使用前注意搖勻。

4. 吸取上清液，加入2 mL/孔的DPBS(不含鈣鎂)，輕輕搖晃數(shù)次，再吸取。

5. 加入2 mL/孔的hESC/iPSC Passage Solution，將細胞置于37培養(yǎng)箱中，計時8-9 min(可參考“六、傳代hESC/iPSC”步驟)。

6. 消化結(jié)束，輕輕取出培養(yǎng)板，吸取hESC/iPSC Passage Solution。

7. 搖勻預(yù)溫的hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入1 mL凍存液，輕柔吹打，水平十字搖勻3次，隨后吸取細胞懸液加入1.5/2 mL凍存管中。

8. 將細胞置于梯度程序降溫盒中，并置-80冰箱中過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮罐中長期保存。

H1人胚胎干細胞培養(yǎng)時需避免的操作失誤

1.細胞培養(yǎng)時要規(guī)范標準

通常培養(yǎng)細胞時會出現(xiàn)污染等問題很大程度原因是由于我們在培養(yǎng)細胞時操作方法不夠標準沒有處理好所造成的，因此在培養(yǎng)細胞時需要加強操作規(guī)范。

(1)嚴格控制無菌操作。在培養(yǎng)設(shè)備和耗材都準備好以后就要做好日常的消毒工作嚴格控制細菌、真菌、微生物等常見的污染。如果條件有限的情況下可以在培養(yǎng)基中添加適當?shù)目股貋矸乐刮廴镜沁@往往會影響到細胞的培養(yǎng)因此要謹慎。

(2)培養(yǎng)環(huán)境需要每日觀察。特別是很多細胞培養(yǎng)時都會在培養(yǎng)箱中進行，其中溫度、適度以及二氧化碳的濃度都會有嚴格的要求，如果在培養(yǎng)時設(shè)備中的環(huán)境出現(xiàn)了偏差那么細胞培養(yǎng)時自然會出現(xiàn)問題，因此在培養(yǎng)時應(yīng)當嚴格檢測好培養(yǎng)設(shè)備及環(huán)境。

(3)細胞培養(yǎng)基及相關(guān)試劑的選擇。培養(yǎng)時會用到培養(yǎng)基、血清、試劑等物品但是選擇的產(chǎn)品應(yīng)該是優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品，劣質(zhì)的產(chǎn)品往往技術(shù)不過關(guān)其中包含很多有害物質(zhì)因此不建議不夠。

H1人胚胎干細胞注意事項

1. 收到H1人胚胎干細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，干冰運輸?shù)募毎麢z查干冰是否揮發(fā)，細胞是否解凍，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。

2. 仔細閱讀H1人胚胎干細胞說明書，了解細胞相關(guān)信息，如細胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細胞因子等，確保細胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細胞出現(xiàn)問題，責任由客戶自行承擔。

3. 請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細胞培養(yǎng)。

4. 建議客戶復(fù)蘇細胞后前3天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運輸?shù)脑颍毎麜霈F(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，告知細胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決。