實時熒光定量PCR（Real-time qPCR）是指在PCR反應中加入熒光基團，通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號出現的先后順序以及信號強弱的變化，即時分析目的基因的初始量的一種PCR技術。

一、熒光化學物質

Real-time qPCR所使用熒光化學物質有熒光染料和熒光探針兩類。

1、熒光染料

目前主要使用的熒光染料是SYBR Green I，SYBR Green I是一種嵌入型花箐染料，在488nm（藍光）照射激發(fā)后，在522nm（綠光）具有發(fā)射高峰。

SYBR Green I是嵌在DNA螺旋的小溝里面的，一般用來染雙鏈DNA，在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結合后，熒光大大增強。因此，SYBR Green I的熒光信號強度與雙鏈DNA的數量相關，可以根據熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數量。

2、熒光探針

Real-time qPCR中常用的熒光探針為TaqMan探針，其基本原理是依據目的基因設計合成一個能夠與之特異性雜交的FRET探針，該探針的5'端標記熒光基團，3'端標記淬滅基團。正常情況下兩個基團的空間距離很近，熒光基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收而不能發(fā)出熒光；PCR擴增時，引物與該探針同時結合到模板上，探針的結合位置位于上下游引物之間；當擴增延伸到探針結合的位置時，PCR酶利用5'→3'外切酶活性將探針酶切降解，使熒光基團和淬滅基團分離，從而使其發(fā)出熒光。

熒光信號被熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收，檢測到的熒光分子數與PCR產物的數量成正比，因此，根據PCR反應體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數量。

1）熒光共振能量轉移FRET

熒光共振能量轉移是指在兩個不同的熒光基團中，如果一個熒光基團（供體 Donor）的發(fā)射光譜與另一個基團（受體 Acceptor）的吸收光譜有一定的重疊，當這兩個熒光基團間的距離臨近至一定范圍時（一般小于100?／10nm），就可觀察到熒光能量由供體向受體轉移的現象，即以前一種熒光基團的激發(fā)波長激發(fā)時，可觀察到后一個基團發(fā)射的熒光。

簡單地說，就是在供體基團吸收一定頻率的光子后第一電子發(fā)生能級躍遷被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過偶極子相互作用，實現了能量向鄰近的受體分子轉移的過程。

此過程沒有光子的參與，所以是非輻射的，供體分子被激發(fā)后，當受體分子與供體分子相距一定距離，且供體和受體的基態(tài)及第一電子激發(fā)態(tài)兩者的振動能級間的能量差相互適應時（同一振蕩頻率），處于激發(fā)態(tài)的供體將把一部分或全部能量轉移給受體，使受體被激發(fā)，在整個能量轉移過程中，不涉及光子的發(fā)射和重新吸收。如果受體熒光量子產率為零，則發(fā)生能量轉移熒光熄滅；如果受體也是一種熒光發(fā)射體，則呈現出受體的熒光，并造成次級熒光光譜的紅移。

①FRET發(fā)生條件：

a.供體分子的發(fā)射光譜應與受體分子的激發(fā)光譜必須有顯著重疊（＞30%）。

b.供體分子與受體分子的作用距離必須在1-10nm之間，基團間的FRET效率可由E=1/［1+(R/R0)?］反映（R表示基團分子之間的距離；R0表示E=50%時供體和受體分子間的距離，依賴熒光基團發(fā)射譜和淬滅基團激發(fā)譜的重疊程度以及基團能量轉移的偶極子的相對方位，對于特定的供體受體對是常數）。

FRET程度與基團之間的空間距離緊密相關，隨著距離延長，FRET呈顯著減弱。

c.供體分子的發(fā)射態(tài)偶極矩與受體分子的吸收態(tài)偶極矩、以及它們的向量必須滿足一定的條件。

b.檢測分子的折疊與構像變化：

2）TaqMan探針

①設計原則：

a.長度：建議15-30bp，以保證結合特異性；擴增子長度應小于150 bp。

二、定量原理

理想的PCR反應：X＝X?*2?；實際的PCR反應：X＝X?*(1＋Ex)?（n：擴增反應的循環(huán)次數，X：第n次循環(huán)后的產物量，X?：初始模板量，Ex：擴增效率）；在擴增產物達到閾值線時：XCt＝X?*(1＋Ex)??＝S （XCt：熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產物的量，在閾值線設定以后，它是一個常數，設為S）；方程式兩邊同時取對數得: lgS＝lg［X?*(1＋Ex)??］，整理方程式得: lgX?＝-lg(1＋Ex) ??＋lgS。

結論：

①模板DNA量越多，達到熒光閾值的循環(huán)數越少，即Ct值越小。

②lg濃度與循環(huán)數呈線性關系。

a. 根據樣品擴增達到閾值的循環(huán)數（Ct值）即可計算出樣品中所含的模板量。(相對定量)

b. 通過已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，根據樣品Ct值，即可計算出樣品中所含的模板量。（絕對定量）

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