PCR（聚合酶鏈式反應）的原理是DNA要經歷變性、退火、延伸步驟才能與引物、DNA聚合酶、dNTP結合形成新的雙鏈DNA分子，但實際需要的目標片段，得在三個循環之后才能得到。因此擴增循環數不能低于3，推薦循環數為30-40個循環。PCR產物的得率計算公式為：

PCR產物得率=2N copies（N代表循環數）

但實際上，隨著循環數的增加，體系中的Taq酶、dNTP、引物等逐漸被消耗并伴隨著副產物的生成，使得PCR不能呈指數擴增，從而使實際的擴增曲線呈現“S”型，通常分為基線期、指數增長期和平臺期三個階段，如圖所示。

PCR擴增曲線

循環數作為一個關鍵步驟，直接影響PCR反應的結果。

如果DNA模板量較少，而循環次數太少，會導致目標DNA片段擴增產量低。

過多的循環雖然能增加產物量，但會導致反應時間過長，非特異性產物擴增和假陽性的風險也隨之上升。一般而言，PCR產物在25～35次循環后即可達最大值，進入“平臺期”。隨著副產物的積累以及試劑的消耗，即使再增加循環數，PCR產物量也不會再有明顯增加，出現擴增無法持續的停滯現象。

圖1. 10167擴增576 bp大腸桿菌菌液，基因來源：擬南芥，性能優于競品。延伸時間為30 sec/kb。循環數34 cycles。

引物設計過程中，需考慮TM值，GC含量、引物長度、引物二聚體的形成，但是往往會忽視3’末端的堿基，小翌建議小伙伴們引物3’末端的堿基最好為G或者C，可以提高引物與模板之間的結合穩定性，降低產物的錯配。

正常引物合成的量為2 OD，引物最初為干粉狀，依據引物質量添加水至100 μmoL/L濃度（儲存液），要使用時稀釋10倍至10 μmoL/L濃度（工作液）即可。

在干粉狀階段，務必在3000 rpm/min條件下，離心1 min。如果未離心，在引物寄送的過程中，隨著快遞的上下翻飛，干粉會掛壁在管內各處，添加的去離子水無法與所有引物混合，導致引物濃度變低，在后續的實驗中可能會導致目的片段的少量擴增或無擴增。

那有的小伙伴希望PCR產物量高，多加一點引物可以嗎？也是不行的，引物濃度如果過高，易造成錯配和非特異性擴增，且引物自身結合的概率增大，更易生成引物二聚體。

如下表顯示，10167ES引物添加量的終濃度為0.4-0.5 μM。依據說明書進行實驗，PCR實驗就可以事半功倍哦~

因為小伙伴的引物作為反復凍融使用的材料，在使用過程中易造成污染，導致非特異擴增，所以小翌建議在使用過程中，引物作為ddH20之后，優先添加的材料，防止因槍頭未更換等因素污染引物。

加樣步驟推薦：ddH20＞引物＞模板＞Mix酶

Mix酶最后添加：防止因過早添加酶試劑導致引物提早合成引物二聚體，避免非特異擴增，且大部分PCR Mix酶攜帶指示劑，可以用于區分該試管是否加樣完成。

需注意，PCR為冰上操作的實驗，但冰塊融化之后，如冰水浸沒引物、模板管子，易造成交叉污染，導致陰性對照出現假陽性。建議丟棄被冰水浸沒過的試劑，更換新試劑做實驗?；蚴褂媒饘俦?，可避免發生浸沒的情況。

模板DNA在儲存的過程中會有一定程度的降解，因此放置前測試的濃度不一定準確，為了保證實驗精度，在放置一段時間后，需重新測試DNA模板濃度。

小翌提醒，在進行酵母菌P的時候，需盡量將酵母模板處理好，有助于提高PCR擴增效率：酵母菌菌液及菌株煮沸5 min后放入-80℃冰箱3 min，待解凍后上樣。

10167ES擴增酵母菌

PCR技術雖然基礎，但也需要精確的控制和細心的調整。通過關注這些小細節，可以提高PCR實驗的成功率，為你的實驗和研究打下堅實的基礎。小翌提醒大家，見微知著，每一個小細節都可能成為PCR成功的關鍵。在分子生物學的世界里，細節往往決定成敗。小翌希望能夠幫助各位科研工作者更好地理解和掌握PCR技術，從而在研究中取得更好的成果！

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快速、高效、抑制停滯現象、提高產量

圖1. 大腸桿菌菌落極限延伸時間擴增測試，3 kb以內片段10167ES擴增的延伸效率可達1 sec/kb，6 kb片段擴增的延伸效率可達3 sec/kb，6-10 kb片段擴增的延伸效率可達5 sec/kb。M：10,000 DNA Marker（10505ES）。

圖2. 長片段+高GC菌液擴增，結果顯示10167ES擴增產量高，檢出率100%，性能優于競品。M：10,000 DNA Marker（10505ES）。10167ES擴增速度10 sec/kb，競品擴增15 sec/kb。