文章原創 阿YiYi 文章來源：科研綜述

基因治療是一種用于治療或預防疾病的醫學技術，通過將健康的基因導入患者體內來替代或修復有缺陷的基因。這種方法旨在糾正導致疾病的基因突變或功能異常，從而恢復或改善患者的正常生理功能。

基因治療的主要原理是通過引入、修復、或編輯患者體內的基因，以糾正或補償導致疾病的遺傳缺陷或基因異常。

圖1. 基因治療原理示意圖 [1]

具體來說，基因治療的核心原理包括：

基因替代

用健康的基因替代缺陷基因，使細胞能夠產生正常功能的蛋白質。例如，將健康的基因導入細胞中，以替代突變的或缺失的基因。

基因修復

通過基因編輯技術直接修復體內的突變基因，恢復其正常功能。常用的基因編輯工具包括CRISPR-Cas9、ZFNs和TALENs。

基因沉默

使用RNA干擾（RNAi）或反義寡核苷酸（ASO）技術抑制有害基因的表達，防止其產生病理性蛋白質。

基因補充

為患者提供缺乏的基因產物（如特定酶或蛋白質），以補償體內的生理缺陷。

圖2. 用于人類基因治療的三種基本工具 [2]。腺相關病毒（AAV）和慢病毒載體是最近獲得批準的多種基因療法的基礎。基因編輯技術目前還處于轉化研究和臨床應用的初期階段，但預計將在該領域發揮越來越重要的作用。

一、病毒載體

1. 腺病毒載體（Adenoviral Vectors）：腺病毒可以感染多種細胞類型并高效傳遞基因，能夠攜帶較大的基因片段進入宿主細胞。由于不整合入宿主基因組，降低了插入突變的風險。然而，由于腺病毒載體可能引發強烈的免疫反應，因此通常用于短期基因表達。
   

圖3. 腺病毒的結構和基因組組織 [3]

1. 腺相關病毒載體（Adeno-Associated Viral Vectors, AAV）：AAV是一種不引起疾病的小型病毒，免疫原性低，能夠攜帶較小的基因片段并將其導入細胞。AAV載體可長期存在于細胞中，并在一定程度上穩定表達目標基因，因此適用于長期基因表達和慢性疾病的治療。

圖4. AAV載體轉導途徑 [4]。腺相關病毒（AAV）載體顆粒首先與靶細胞表面的受體和共受體結合（步驟1），并通過內吞作用進入這些細胞的內涵體（步驟2）。從內涵體釋放后，AAV顆粒要么被泛素化并針對蛋白酶體介導的降解（步驟3），要么在細胞內被轉運至細胞核（步驟4）。一旦進入細胞核，AAV顆粒的衣殼被去除，AAV基因組被釋放（步驟5）。然后，AAV的單鏈DNA基因組被轉化為雙鏈DNA（步驟6），接著是轉錄（步驟7）和mRNA的核輸出（步驟8），以便進行翻譯和治療性轉基因的表達（步驟9）。通過工程化改造AAV載體影響其轉導途徑的任何步驟都會影響其轉導效率。 ER：內質網；ssAAV：單鏈AAV；Ub：泛素。
3. 慢病毒載體（Lentiviral Vectors）：慢病毒載體是一種來源于HIV-1的病毒載體，能夠將基因整合到宿主細胞的基因組中，實現穩定且長期的基因表達。

圖5.第三代慢病毒載體[5]。第三代慢病毒載體由兩個獨立的包裝質粒組成，一個編碼gag和pol，另一個編碼rev。此外，還有一個質粒編碼來自VSV-G（水皰性口炎病毒）的包膜蛋白。編碼目標基因的質粒包含經過改造的慢病毒LTR（長末端重復）序列，這些序列被改造成自滅活（SIN）型，以防止重組。LTR指長末端重復，VSV指水皰性口炎病毒。這種載體不僅能夠感染分裂中的細胞，還可以感染非分裂細胞，因此在基因治療中具有廣泛的應用。慢病毒載體特別適用于治療血液系統疾病和遺傳性疾病，如β-地中海貧血和X-連鎖重癥聯合免疫缺陷癥（SCID）。

圖6.慢病毒載體的主要臨床用途 [5]。a.原發性免疫缺陷的矯正。使用病毒載體傳遞共同γ鏈（γc），可以恢復SCID-X1患者的免疫功能。b. 腫瘤特異性T細胞受體（TCR）的傳遞。慢病毒載體可用于在體外將識別黑色素瘤抗原的MART-1 TCR引入患者的T細胞中。經過修飾的T細胞現在能夠識別黑色素瘤細胞，并作為癌癥治療手段被輸注回患者體內。 c. 嵌合抗原受體（CAR）T細胞療法。使用慢病毒載體可以將由三個不同結構域（抗原識別、共刺激信號傳導、T細胞信號傳導）構成的CAR引入T細胞中。表達修飾受體的細胞能夠識別目標抗原，并利用T細胞強大的細胞毒活性攻擊腫瘤細胞。目前，大多數臨床試驗中的CAR T細胞療法靶向CD19抗原，這是一種在B細胞和B細胞惡性腫瘤中表達的蛋白質。 SCID：重癥聯合免疫缺陷癥。

4. 逆轉錄病毒載體（Retroviral Vectors）：逆轉錄病毒載體可以將基因插入宿主細胞的基因組中，實現長期表達，主要在分裂中的細胞中起作用。盡管這種載體常用于血液系統疾病的治療，但其可能導致插入突變，從而引發其他健康問題。

圖7. 逆轉錄病毒靶向策略 [6]。逆轉錄病毒載體可以通過以下方式進行改造：插入配體或抗體片段（工程化糖蛋白）、使用來自其他逆轉錄病毒的糖蛋白（偽型化），或使用雙特異性抗體（非遺傳靶向）。

二、非病毒載體

1. 質粒（Plasmid DNA）：質粒DNA通過電穿孔或脂質體轉染等物理或化學方法導入細胞。這些方法在體外實驗中廣泛應用，因其較低的免疫原性和無病毒成分的特性，適合初步研究。然而，質粒DNA通常不能整合到宿主基因組中，因此基因表達往往是暫時的。對于某些長期基因表達的應用，質粒的短暫表達可能是一個限制因素。

圖8.三重轉染策略用于AAV生產[7]。這種方法通過引入關鍵基因至一個DNA質粒（左上方），以及兩個其他質粒（左下方），消除了對“輔助”腺病毒的需求。這三個質粒被轉染到生產細胞系中（中間），該細胞系會產生包含目標轉基因的成熟AAV衣殼。經過純化（右側）后，這些病毒顆?？梢愿腥净颊呒毎鬟f其DNA載荷，但無法進一步復制。

2. 脂質體（Liposomes）：脂質體是一種由脂質雙層包裹DNA或RNA的非病毒載體。通過與細胞膜融合，脂質體能夠將包裹的基因物質導入細胞。脂質體的優勢在于其低免疫原性和生物相容性，但其基因轉染效率較低，特別是在體內應用時。這種方法通常用于將小核酸（如siRNA）導入細胞，且更適合短期基因表達或局部治療。

圖9. 針對基因治療使用的不同類型脂質體的研究分布情況[8]

3. 聚合物納米顆粒（Polymer Nanoparticles）：聚合物納米顆粒通過化學聚合物材料包裹基因物質，形成能夠通過細胞內吞進入細胞的納米顆粒。這種技術允許對聚合物材料的物理化學性質進行調整，以優化基因轉移效率并降低免疫反應。盡管聚合物納米顆粒展示了良好的潛力，特別是在定向治療和藥物釋放方面，但其基因傳遞效率在體內應用中仍需要進一步改進。

圖10. 用于DNA和siRNA細胞內遞送的聚合物納米顆粒[9]。(1) 陰離子DNA和siRNA與陽離子聚合物復合形成聚合物復合體； (2) 通過不同的內吞途徑將聚合物復合體攝入細胞； (3) 聚合物復合體在內體-溶酶體隔室中包裹并隨后釋放； (4) 聚合物復合體釋放自由的DNA和siRNA，留下聚合物殘余；(5) DNA通過核膜轉運蛋白轉移至細胞核進行表達，siRNA與RNA誘導的沉默復合體（RISC）結合。

三、基因編輯工具

1. CRISPR-Cas9：CRISPR是一種強大的基因編輯工具，可以精確地切割并修復特定基因，從而糾正基因突變或刪除有害基因。CRISPR技術應用廣泛，已被用于多種疾病的基因治療研究。
   

圖11. 基因組編輯平臺及內源DNA雙鏈斷裂（DSB）修復機制[10] ?；蚪M編輯核酸酶（如ZFN、TALENs和CRISPR/Cas9）在靶向位點誘導雙鏈斷裂（DSB）。雙鏈斷裂可以通過非同源末端連接（NHEJ）修復，或在存在供體模板的情況下通過同源重組（HDR）修復。通過NHEJ靶向位點進行基因破壞會導致插入/缺失突變（indels）的形成。當兩個雙鏈斷裂靶向致病擴增或插入的兩側時，可以創建對中間序列的治療性缺失，從而實現NHEJ基因修正。在存在供體修正的HDR模板的情況下，HDR基因修正或基因添加會在期望的位點誘導雙鏈斷裂。縮寫：DSB，雙鏈斷裂；ZFN，鋅指核酸酶；TALEN，轉錄激活因子樣效應核酸酶；CRISPR/Cas9，簇集規律間隔短回文重復相關9核酸酶；NHEJ，非同源末端連接；HDR，同源重組修復。

1. TALENs（轉錄激活樣效應因子核酸酶）：通過識別特定的DNA序列進行定點切割，實現基因編輯。

3. 鋅指核酸酶（ZFNs）：使用鋅指蛋白結合特定DNA序列進行基因編輯。

四、RNA干擾（RNAi）和小RNA（siRNA）

用于基因沉默，通過引入特定的siRNA或shRNA抑制特定基因的表達，達到治療效果。

圖12. miRNA（a）和siRNA（b）的工作機制示意圖 [11]

五、基因剪接技術

例如 Spliceosome-mediated RNA trans-splicing (SMaRT)，通過改變mRNA剪接，修復或替換有缺陷的基因序列。

圖13. 三種SMaRT方法的示意圖 [12]。5'轉接剪接、3'轉接剪接和內部剪接修復（IER），分別靶向突變目標前體mRNA的5'端、3'端或內部部分。

基因治療的應用領域非常廣泛，涵蓋了多種遺傳性疾病、癌癥、罕見病以及某些感染性疾病。

一、遺傳性疾病

基因治療在單基因遺傳病中取得了顯著進展，例如：

• 脊髓性肌（SMA）：通過將SMN1基因的功能性副本導入患者體內，可以顯著改善患者的運動功能和生存率。Zolgensma是針對SMA的基因治療藥物，已被批準用于臨床。

圖14. 脊髓性?。⊿MA）基因治療的簡化示意圖[13]

血友?。?/span>通過基因治療將功能性凝血因子基因導入患者體內，可以減少或消除患者的出血癥狀。Spark Therapeutics開發的基因療法已經在臨床試驗中展示了良好的療效。

圖14.AAV基因治療血友病的歷史回顧 [2]

鐮刀型細胞貧血癥和地中海貧血：通過將正常的β-珠蛋白基因引入患者的造血干細胞，能夠糾正血紅蛋白的生成缺陷，減輕或消除疾病癥狀。

圖15：鐮狀細胞病基因治療的步驟。

二、癌癥

嵌合抗原受體T細胞療法（CAR-T）：通過基因工程手段改造患者的T細胞，使其能夠識別并殺死癌細胞。CAR-T細胞療法在治療B細胞白血病和淋巴瘤中表現出顯著的療效，并已獲得FDA批準。

圖16. 癌癥患者中CAR T細胞的生成和施用[14]。(A) T細胞通過血液單采從患者的血液中收集。隨后，它們被基因工程改造以表達CAR，并在體外進行培養擴增。然后將CAR T細胞輸注回患者體內，這些細胞識別其靶標并殺死表達該靶標的腫瘤細胞。 (B) 四代CAR T細胞基本結構的示意圖。

圖17. CAR-T細胞療法的歷史概述 [2]

腫瘤抑制基因恢復：基因治療還可以通過恢復或增強腫瘤抑制基因（如p53）的功能，抑制腫瘤的生長和擴散。

三、罕見病

視網膜疾病：基因治療在治療某些遺傳性視網膜疾?。ㄈ鏛eber先天性黑矇癥）方面取得了成功。Luxturna是一種用于治療RPE65基因突變引起的遺傳性視網膜疾病的基因治療藥物，已被批準用于臨床。

圖18. 基于RPE65基因治療的臨床前里程碑[15]

代謝性疾病：例如肝豆狀核變性，通過基因治療將缺陷的ATP7B基因功能恢復，可以糾正體內銅代謝異常，預防嚴重的肝臟和神經系統損傷。

四、心血管疾病

家族性高膽固醇血癥（FH）：通過基因治療糾正低密度脂蛋白受體（LDLR）的基因突變，可以降低患者的膽固醇水平，減少心血管疾病的風險。

圖19. 針對家族性高膽固醇血癥（FH）患者的新興基因治療方法 [16]。小干擾RNA（siRNA）和反義寡核苷酸（ASO）可以通過基因沉默抑制PCSK9和其他不利于降脂的靶點；CRISPR-Cas9、基因編輯和巨核酸酶可以修復功能失調的LDLR或通過基因編輯生成LDLR，從而使不利于降脂的靶點失活；腺病毒、外泌體和基于紙納米抗體的遞送工具可以將上述物質遞送至肝細胞。

五、感染性疾病

HIV：基因治療正在探索通過基因編輯或基因轉移手段，抵御HIV感染。例如，通過CCR5基因敲除技術，賦予T細胞對HIV的抗性，阻止病毒入侵。

圖20. 傳統的HIV基因治療.(A) 體外基因遞送[17]。使用合適的載體在體外對自體CD4+ T細胞或CD34+造血干祖細胞（HSPCs）進行基因修飾。修飾后的基因細胞被輸注回患者體內。 (B) 基因修飾HIV靶細胞的陽性選擇。HIV在易感的HIV靶細胞（紅色）中復制?；蛐揎椀募毎ňG色）對感染具有抵抗力，并累積到具有治療意義的水平。 (C) HIV復制周期和基因治療示例。RT，HIV逆轉錄酶；IN，HIV整合酶。

六、神經系統疾病

帕金森?。?/span>基因治療在帕金森病中的應用研究包括通過將編碼多巴胺合成酶的基因引入基底神經節，以補充多巴胺缺乏，從而減輕帕金森病的癥狀。

圖21. 基因治療在神經退行性疾病中的遞送途徑 [18]。盡管通過靜脈注射或腦脊液（鞘內、腦室內和腦膜下路徑）給藥可以有效治療多灶性疾病，但實質內注射是腦部疾病常用的遞送途徑。對于眼部疾病來說，局部基因遞送更為優選，因為其手術和器械操作相對簡單。肌內注射提供了一種疫苗和抗體遞送及生產的策略，而子宮內注射可能為治療遺傳性神經退行性疾病提供一種方法。

亨廷頓?。?/span>研究人員正在探索通過基因沉默技術（如RNA干擾）抑制導致亨廷頓病的突變基因表達，從而延緩或阻止疾病進展。

七、免疫缺陷疾病

重癥聯合免疫缺陷癥（SCID）：通過將正常的IL2RG基因或ADA基因引入患者的造血干細胞中，基因治療能夠恢復患者的免疫功能。這一技術已經在多例SCID患者中取得成功，顯著提高了患者的生存率。

圖22. IL2RG基因位點的基因組靶向,基因組整合和修正結果的示意圖[19]

基因治療的應用正在快速擴展，并隨著技術的進步和臨床經驗的積累，越來越多的疾病將能夠通過基因治療得到有效的治療。盡管基因治療仍面臨許多挑戰，如治療的長期效果、安全性、成本和倫理問題，但其在臨床上的成功應用已經顯現出巨大的潛力。

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