外泌體是納米級的細胞外囊泡，主要調節細胞間通訊。它們在納米醫學中具有巨大的應用潛力。然而，其分離技術因為昂貴儀器和試劑受到限制。仿生納米技術為藥物、RNA干擾（RNAi）、蛋白質遞送和無藥物療法提供強大的支架，極大地影響了生物醫學。在大流行期間，納米技術在世界范圍內mRNA疫苗和診斷試劑盒的開發中發揮了重要作用。然而，傳統納米材料在臨床的轉化因靶點識別能力差和成本高昂從而受到影響。在這方面，外泌體可能是解決上述問題的一個不錯選擇。

外泌體是細胞外囊泡，大小范圍為30-200 nm，幾乎所有類型的細胞都會分泌。它們通過攜帶DNA、RNA、RNAi、蛋白質、病毒、脂質、小分子和可溶性因子等多種有效載荷參與細胞間通訊。這些物質以旁分泌方式從親本（供體）輸送到受體細胞。外泌體繼承了有效載荷傳遞能力，這使它們成為藥物輸送的理想載體，通過將所需的物質裝載在其內部或表面。外泌體也可用作某些疾病的診斷標志物，例如神經退行性疾病和癌癥。外泌體還有穿越體內所有生理屏障的能力，以及與血腦屏障（BBB）相關的能力，這在改善腦部疾病或切除腦癌方面存在重大意義。外泌體可以從所有體液中分離出來，包括血漿、尿液、腦脊液、羊水、胸腔積液、腹水、支氣管肺泡杠桿、細胞培養等，它們大量存在于所有體液中。基于外泌體的無細胞療法具有高濃度和易于進入細胞和器官的特點，在生物醫學中具有顯著的優勢。

有幾種有效的外泌體分離方法，包括原型超速離心（用于80%的細胞外研究）、通過聚乙二醇（PEG）的密度梯度試劑、尺寸排阻色譜（SEC）和免疫沉淀等。然而，這些方法有一定的局限性，即超速離心機或商業試劑盒的成本高。此外，分離的外泌體樣品的純度、大小和濃度及其功能取決于所采用的分離方法。

凍干（真空冷凍干燥）現在通常用于延長富集外泌體的儲存時間。目前，它在外泌體分離中的應用是比較新穎的。有趣的是，大多數外泌體儲存緩沖液都有一個維持其結構和功能的方法。例如，4%海藻糖或10% w/v山梨糖醇和蔗糖有利于富集外泌體顆粒的冷凍干燥。同樣，理想的pH值為6.5-7.5，氨基酸、谷氨酸和1%FBS對外泌體的凍干過程是有利的，以避免冷凍休克并保持外泌體顆粒的結構完整性。同樣，對于細胞培養基，Dulbecco改良的Eagle培養基（DMEM）富含葡萄糖，pH值為6.8-7.4，主要富含L型谷氨酸，并補充10%FBS。與凍干的外泌體顆粒儲存培養基類似，也就是說細胞培養基可以保護外泌體。因此，基于凍干的技術能夠通過冷凍干燥老化的細胞培養基來分離外泌體。然而，我們仍然需要依靠傳統的外泌體分離技術進行洗滌。盡管SEC或超速離心可以在一定程度上達到這種效果，但沒有一種分離方法可以純化外泌體樣品免受蛋白質污染。

1、打開凍干機預冷，設置好凍干程序包括預凍和升華程序。

2、對樣品進行前處理，加入合適的保護劑進行預凍。如葡聚糖，甘露糖，海藻糖，復合保護劑。將樣品分裝到合適的容器內，放置于凍干機隔板上，Mercury凍干機隔板均勻度達到了±1°C，可保證樣品的均一凍干狀態。

3、啟動設置好的凍干程序，即預凍至-45℃，持續時間5h。升華程序-45℃～20℃，持續時間32h。此步驟可以利用凍干終點判斷功能，預估完成時間，可縮短反復查看的時間。

4、程序結束后，釋壓取出凍干好的樣品，觀察樣品狀態是否達到預期。如果達到隨即儲存或者進行后續實驗。

實驗結果：無保護劑組，外泌體直接凍干，凍干后比較松散。加入5%甘露醇后樣品更為美觀，且保存效果好。

凍干前后對比圖如下：

凍干前 VS 凍干后

   左3為加入甘醇后樣品