前  言

AKT激活是多種生命活動及疾病的信號中樞，而AKT Ser473位的磷酸化是AKT完-全激活的必要步驟。AKT抑制劑藥物三期臨床實驗結(jié)果表明其能有效延長荷爾蒙受體陽性乳腺癌患者的無進展生存期。在AKT相關(guān)研究中，磷酸化抗體是最重要的工具之一。

01 AKT分子機制

AKT的蛋白名為RAC-alpha serine/threonine-protein kinase或Protein kinase B (PKB)。AKT在所有人源細胞類型中皆有表達，人源AKT激酶有三種：AKT1、AKT2、AKT3，三種AKT同源性較高，結(jié)構(gòu)域類似。AKT N端有pleckstrin homology (PH) 結(jié)構(gòu)域，能夠和PIP3結(jié)合，C端包含激酶結(jié)構(gòu)域（KD）和C末端結(jié)構(gòu)域（CTD）。

AKT蛋白結(jié)構(gòu)（圖片源自doi.org/10.1186/s13045-021-01137-8）

靜息狀態(tài)下，AKT的PH結(jié)構(gòu)域和C端激酶結(jié)構(gòu)域靠近（PH-in構(gòu)象），抑制AKT激活。當細胞接受PDGFa、IGF1等多種細胞因子刺激后，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，PI3K將PI4,5P2轉(zhuǎn)變?yōu)镻IP3。AKT的PH結(jié)構(gòu)域與PIP3結(jié)合，釋放C端激酶結(jié)構(gòu)域（PH-out構(gòu)象）。其后，PDK1磷酸化AKT1的308位蘇氨酸，初步激活A(yù)KT，然后mTORC2磷酸化AKT1的473位絲氨酸（對應(yīng)AKT2 Ser474，AKT3 Ser472）。AKT1 Ser473位的磷酸化對于T308位磷酸化的維持有重要作用，是AKT完-全激活的標志。

AKT激活過程（圖片源自doi.org/10.1016/j.cell.2017.04.001）

AKT能夠激活包括mTORC1、GSK3β、FOXO在內(nèi)的100多種底物，是信號通路的中-央樞紐之一，調(diào)控了細胞及機體的代謝、生存、增殖。在多種腫瘤中，AKT的正向調(diào)控原件PI3K往往產(chǎn)生突變，異常激活，而負向調(diào)控原件PTEN突變失活，這最終導(dǎo)致了AKT的過度激活，增強了腫瘤細胞的生存遷移能力。因此，以AKT為靶點的治療藥物是研發(fā)熱點。

02 AKT抑制劑研究進展

在乳腺癌等多種腫瘤中，由于上游調(diào)控原件PI3K異常激活或PTEN的突變失活，AKT會持續(xù)激活，開啟下游一系列信號通路，進而增強腫瘤細胞的增殖、遷移能力。Capivasertib是一種吡咯嘧啶衍生的化合物，能夠和AKT的ATP結(jié)合位點結(jié)合，導(dǎo)致AKT無法磷酸化底物，抑制下游信號通路。Capivasertib能夠在10nM級別抑制所有AKT激酶（AKT1 IC50=3nM，AKT2 IC50=7nM，AKT3 IC50=7nM）。

2023年6月1日，英國癌癥研究院等在新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志上發(fā)表了Capivasertib的三期臨床試驗結(jié)果。該試驗?zāi)技?08例荷爾蒙受體陽性、表皮生長因子2型受體陰性的進展期乳腺癌患者，與僅接受fulvestrant治療的患者（無進展生存期PFS=3.6 Months）相比，接受Capivasertib-fulvestrant聯(lián)合治療的患者無進展生存期（7.2 Months）顯著增強（HR=0.6, 95% CI:0.51-0.71, P<0.001）。該結(jié)果為Capivasertib-fulvestrant療法以及其他AKT靶點藥物開發(fā)提供了光明前景。

03 AKT ser473磷酸化抗體

無論是生理研究，還是病理研究中，AKT Ser473的磷酸化都是AKT是否激活的關(guān)鍵指標，是相關(guān)信號通路研究中必-不可少的檢測靶點。相比于普通抗體，磷酸化抗體不僅需要識別特定的蛋白，還需要識別是否在蛋白的特定氨基酸上發(fā)生磷酸化。AKT Ser47磷酸化抗體能夠特異性的檢測AKT是否在第473位的絲氨酸發(fā)生磷酸化。

義翹神州現(xiàn)在推出AKT Ser473磷酸化抗體（Cat: 110591-R0113）。通過自有的兔單B流式分選技術(shù)制備的兔單克隆抗體具有高特異性（內(nèi)源性驗證、競爭驗證）、高靈敏度（1:200000）等特點。

?義翹神州磷酸化抗體驗證數(shù)據(jù)

內(nèi)源性驗證

Western blot analysis of extracts from serum-starved NIH-3T3, untreated (-); treated with PDGFA (Cat: 13081-H07Y) (5 μg/mL, 5 min; +), using Phospho-AKT (Ser473) rabbit monoclonal Antibody (Cat:  110591-R0113) at 1:2000 dilution (upper) or anti-Akt antibody (lower).

Western blot analysis of extracts from serum-starved A431, untreated (-); treated with EGF (Cat: GMP-10605-HNAE) (200 ng/mL, 15 min; +), using Phospho-AKT (Ser473) rabbit monoclonal Antibody (Cat: 110591-R0113) at 1:2000 dilution (upper) or anti-Akt antibody (lower).

特異性驗證

Western blot analysis of extracts from serum-starved NIH-3T3, untreated (line A); treated with PDGFA (Cat: 13081-H07Y) (5 μg/mL, 5 min), without peptide (line B) or antigen-specific phosphopeptide (line C) or antigen-specific peptide (line D) using Phospho-AKT (Ser473) rabbit monoclonal Antibody (Cat: 110591-R0113) at 1:2000 dilution.

超高稀釋度

Western blot analysis of extracts from serum-starved NIH-3T3 treated with PDGFA (Cat: 13081-H07Y) (5 μg/mL, 5 min; +), using Phospho-AKT (Ser473) rabbit monoclonal Antibody (Cat: 110591-R0113) at 1:1000, 1:50000, 1:200000 dilution.

【參考文獻】 

1. Andrikopoulou, A., et al. The emerging role of capivasertib in breast cancer. Breast, 2022. doi.org/10.1016/j.breast.2022.03.018

2. Davies, B. R., et al. Preclinical pharmacology of AZD5363, an inhibitor of AKT: pharmacodynamics, antitumor activity, and correlation of monotherapy activity with genetic background. Mol Cancer Ther, 2012. doi.org/10.1158/1535-7163.Mct-11-0824-t

3. Hua, H., et al. Targeting Akt in cancer for precision therapy. J Hematol Oncol, 2021, doi.org/10.1186/s13045-021-01137-8

4. Manning, B. D., & Toker, A. AKT/PKB Signaling: Navigating the Network. Cell, 2017, 381-405. doi.org/10.1016/j.cell.2017.04.001

5. Turner, N. C., et al. Capivasertib in Hormone Receptor-Positive Advanced Breast Cancer. N Engl J Med, 2023. doi.org/10.1056/NEJMoa2214131