固相萃取（SPE）

SPE是一種功能強(qiáng)大的樣品制備技術(shù)，幾十年來一直用于各種生物樣品中微量分析物的選擇性提取和富集。SPE的作用機(jī)制與液相色譜法類似，它是基于溶解在液體（流動相）中的溶質(zhì)（感興趣的分析物）和吸附劑材料（固定相）之間的親和性或相互作用。由于物理化學(xué)性質(zhì)的不同，液體樣品中的不同組分在SPE器件的固定相中與吸附劑有不同的親和性或相互作用。通過SPE，液體樣品經(jīng)過適當(dāng)處理（稀釋、pH調(diào)整和/或添加IS)后，裝載到填充適當(dāng)吸附材料的預(yù)處理/平衡柱/筒/板上；通過不同的吸附材料相互作用（固定相）相互作用被保留；干擾基質(zhì)組件在加載過程中直接通過柱/筒/板，或在清洗過程中用適當(dāng)?shù)娜軇┣逑矗浑S后用合適的洗脫溶劑從柱/筒/板中洗脫感興趣的分析物。收集到的洗脫液要么直接進(jìn)行LC-質(zhì)譜分析，要么進(jìn)行干燥過程以蒸發(fā)有機(jī)溶劑。在LC-質(zhì)譜分析之前，用適當(dāng)?shù)娜軇┲亟M或開始流動相。使用SPE，可以預(yù)防或最小化與PPT和/或LLE相關(guān)的一些問題。這些問題包括但不限于(i)PPT中的基質(zhì)效應(yīng)和（ii）LLE中不wanquan相分離導(dǎo)致的恢復(fù)較差。SPE產(chǎn)品可從各種供應(yīng)商處提供各種化學(xué)物質(zhì)、吸附劑、尺寸和格式，以適應(yīng)不同的樣品尺寸和生物分析應(yīng)用。

SPE固定相（吸附劑）

SPE吸附劑材料通常是不規(guī)則形狀的剛性顆粒，標(biāo)稱尺寸從8到70μm（最常見的是40-60μm），這允許在加載、洗滌和洗脫過程中樣品或溶液通過吸附劑床的合理的流速。SPE吸附材料的較小顆粒需要更高的壓力。例外的是板格式的吸附劑材料。由于這種格式的床路徑非常短，由于粒徑小，所產(chǎn)生的總電阻小于格式化成柱或盒的典型吸附床。大多數(shù)SPE材料在本質(zhì)上是wanquan多孔的。吸附劑材料的小孔隙率與較高的總表面積有關(guān)，因此，吸附劑材料的活性吸附容量更高。通常，SPE吸附劑中給定的吸附劑材料的容量約為每質(zhì)量吸附劑的百分之一（%）保留化合物（例如，5毫克化合物被100毫克吸附劑保留）。SPE吸附劑可大致可分為兩大類，即硅基吸附劑和聚合物基吸附劑。

硅基吸附劑：根據(jù)定義，硅基吸附劑是通過將不同的官能團(tuán)與硅結(jié)合而制成的，盡管堿基硅在一些SPE工作流程中也起著積極的作用。許多商業(yè)上可用的硅基吸附劑都使用首字母縮寫來命名。這些首字母縮寫描述了二氧化硅上各自官能團(tuán)的主要特征，包括C18、C8、C6、C4、C2、苯基、環(huán)己基、氰丙基、氨基丙基、二乙胺、二醇、丙基磺酸、苯磺酸、丙基羧酸和丙基三甲基胺?；赾18的SPE柱/墨盒/板是非常受歡迎的和最疏水性的。由于其很強(qiáng)的疏水性，它們對許多化合物具有很強(qiáng)的保留性。然而，它可能不能提供好的選擇性。為了在SPE中獲得更好的選擇性，可以使用疏水相較少的SPE柱/墨盒/板，如c8柱，這也非常流行。

無論在制造硅基SPE吸附劑時使用哪種鍵化學(xué)，由于結(jié)合官能團(tuán)的空間因素，殘留在吸附劑表面的未反應(yīng)（或殘留的）硅醇種類的數(shù)量仍然很高（典型的c18鍵相的>50%）。這些硅醇物種能夠與分析物分子相互作用，往往導(dǎo)致意外的保留效應(yīng)和較低的提取效率。在溶液的pH ~4中，硅表面約50%的硅醇被電離。因此，可以調(diào)整溶液pH，以確保硅烷醇物種的離子抑制（pH≤2）或wanquan電離（pH≥6）。需要注意的是，當(dāng)暴露在jiduanpH中時，硅吸附劑可能會被水解。在pH值為2時，鍵合表面易于水解，吸附劑的效率可以大大降低。在pH值為8時，二氧化硅本身易于水解，吸附劑在長期暴露后迅速惡化。

聚合物基吸附劑：各種聚合物基吸附劑在商業(yè)面上，涵蓋了廣泛的極性和化學(xué)性質(zhì)。最常見的聚合物吸附劑是基于苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。通過胺化或磺化的進(jìn)一步修飾有助于創(chuàng)建離子交換聚合物吸附劑。一些極性官能團(tuán)的摻入使吸附劑可潤濕，這為保留機(jī)制提供了額外的可能性。聚合物基固定相的一個重要優(yōu)點是，即使它們在SPE過程中干燥，它們的化學(xué)性質(zhì)也不會改變，而且用于硅基SPE柱/墨盒/板的初始調(diào)節(jié)步驟可能不需要。此外，與硅基吸附劑相比，大多數(shù)聚合吸附劑在整個pH范圍內(nèi)是穩(wěn)定的。

LC-MS生物分析中常用的SPE平臺

根據(jù)各自的保留機(jī)制，LC-MS生物分析中常用的SPE可分為三類，即反相SPE、離子交換SPE和混合模式SPE。正相SPE設(shè)計用于從有機(jī)提取物、極非極性溶劑和油脂等中提取分析物。由于它很少應(yīng)用于血漿和尿液等生物基質(zhì)的樣品提取，因此不包括在目前的討論中。

●反相SPE：它采用了硅基或聚合物基吸附劑的非極性固定相，它們保留了大多數(shù)具有任何疏水特性的分子。硅基非極性吸附劑的常見官能團(tuán)包括但不限于C18、C8、C6、C4、C2、C1、苯基、環(huán)己基和氰丙基。在這些類群中，短鏈鏈（如C1、C2）的保留性較低，而長鏈（如C18）的保留性較強(qiáng)。與其他類型的SPE相比，反相SPE被認(rèn)為是最少的選擇性保留機(jī)制。正因為如此，它對于在同一樣本中提取結(jié)構(gòu)非常不同的分析物非常有用。

●離子交換SPE：它利用吸附劑的離子官能團(tuán)（強(qiáng)或弱有機(jī)酸和堿），可以進(jìn)一步分類為強(qiáng)/弱陽離子/陰離子離子交換SPE：

1. 強(qiáng)陽離子交換（SCX）SPE：吸附劑通常含有磺酸作為離子交換的離子基團(tuán)?；撬岬膒Ka值很低，并且?guī)缀踉谡麄€pH范圍內(nèi)都帶負(fù)電荷。

2. 弱陽離子交換（WCX）SPE：吸附劑中通常含有羧酸作為離子基團(tuán)。羧酸是弱酸，pKa值在4.5-5.0左右，僅在部分pH范圍內(nèi)被電離。如果SPE柱/盒/板中的pH調(diào)整到pH值3以上，離子交換器就會逐漸“打開”。相反，如果pH被降低到pH值3以下，離子交換器就會“關(guān)閉”。

3. 強(qiáng)陰離子交換（SAX）SPE：吸附劑通常含有季胺基團(tuán)作為官能團(tuán)。季胺在整個pH范圍內(nèi)都帶正電荷。

4. 弱陰離子交換（WAX）SPE：吸附劑中通常含有仲胺或叔胺作為離子交換的官能團(tuán)。二胺或叔胺為弱堿基，pKa值為~值10。因此，通過調(diào)整pH值>為10，離子交換器逐漸“關(guān)閉”。相反，如果pH被調(diào)整到遠(yuǎn)低于pH值為10，即pH值為8或更低，離子交換器就會“打開”。

   ●混合模式SPE：混合模式SPE是一種提取方法，涉及吸附劑表現(xiàn)出兩個或更多的主要相互作用，以保留感興趣的分析物。商業(yè)上可用的混合模式吸附劑可以是硅或聚合物基的，通常通過將吸附劑與兩個不同的官能團(tuán)（如C2、C8與硫酸鹽）同時結(jié)合，或以適當(dāng)?shù)谋壤旌想x散吸附劑化學(xué)，以創(chuàng)建保留性能的組合。常用的混合模式吸附劑具有疏水官能團(tuán)與離子交換官能團(tuán)結(jié)合。疏水基團(tuán)可以是短鏈（如C2)，也可以是長鏈（如C18)這是高度保留的。離子交換器可以是陽離子取向或陰離子導(dǎo)向的。混合模式SPE允許通過離子和疏水相互作用使化合物保留

一般SPE工作流

從技術(shù)上講，SPE是一種低壓色譜法的形式，可以通過LC-MS系統(tǒng)離線或在線進(jìn)行。在開發(fā)基于SPE的LC-MS生物分析樣品制備方法時，除了相關(guān)分析物的理化性質(zhì)外，需要考慮的參數(shù)包括(i)吸附劑的類型和數(shù)量，（ii）樣品體積（考慮初始分析、重復(fù)分析和發(fā)生的樣品再分析所需的體積），以及（iii）加載、洗滌和洗脫條件（時間、體積和成分）。

與LC柱類似，各種SPE產(chǎn)品有各種形式的商業(yè)。這些包括但不限于一次性墨盒，多孔板（96孔，384孔），和來自一些主要供應(yīng)商的在線SPE柱。一般來說，每個特定的SPE產(chǎn)品都提供了供應(yīng)商推薦的程序或方法協(xié)議。這些程序或協(xié)議應(yīng)被視為對感興趣的分析物的預(yù)期SPE方法的方法開發(fā)的起點。

反相SPE

反相SPE是從水溶液中提取相對非極性分析物的常用方法。

●萃取機(jī)理：被分析物與固定相之間的疏水相互作用。通過范德華力，隨著分析物的疏水性的增加而增加，這主要是在固定相中的氫碳鍵和分析物分子中的氫碳鍵之間。這種相互作用在水相中被促進(jìn)，但在有機(jī)相中被抑制或破壞。

●適用分析物：logP值為>1.0的化合物，可以考慮大多數(shù)商業(yè)化的硅基或聚合物基反相SPE。然而，對于logP值在?1.0到1.0之間的化合物，最好考慮改性聚合物基反相SPE，因為聚合物基SPE吸附材料的極性改性比硅基C18或C8材料的極性選擇性增加；對于logP值為<?0.1的化合物，它們在反相SPE上的保留率較差，一般不推薦反相SPE。

●樣品預(yù)處理：樣品需要用適當(dāng)?shù)木彌_液或水稀釋（對于中性化合物）。對于可電離化合物，pH的調(diào)整是重要的，因為感興趣的分析物(s)的電離狀態(tài)可以極大地改變其在給定的RP SPE吸附劑上的保留和洗脫特性。一般規(guī)則是將樣品pH調(diào)整到高于（堿性化合物）或低于（酸性化合物）pKa值的2個pH值，以確?；衔镌谘b入SPE柱/盒/板之前被中和。除了常用的緩沖液，一些常見的試劑，如2%甲酸、2%羧酸、2%乙酸、TFA、磷酸或氫氧化銨、碳酸氫鈉、碳酸鈉，可用于樣品處理。

●活化：吸附劑調(diào)節(jié)是“激活”或“濕”SPE吸附劑，以確保感興趣的分析物(s)與SPE吸附劑的官能團(tuán)之間的一致相互作用。最常見的調(diào)節(jié)方法是將一到兩體積的水混溶有機(jī)溶劑（通常是甲醇或乙腈）應(yīng)用于反相吸附劑。隨后，通過引入一種在溶劑強(qiáng)度和pH方面類似于樣品裝載的溶液來平衡SPE吸附劑，以最大限度地保留對SPE吸附劑感興趣的分析物。一到兩體積的緩沖液（與樣品預(yù)處理相同）或水（對于中性化合物）是平衡反相吸附劑的常用選擇。

●裝樣：裝樣的關(guān)鍵因素是樣品通過SPE吸附劑時的線速度，以確保最佳保留。對于離線應(yīng)用，樣品通常被允許通過自然重力流動，以確保樣品與感興趣的分析物(s)與固定相的接觸時間。水樣可以直接加載到平衡的反相SPE柱/筒/板上。被分析物的非極性性質(zhì)導(dǎo)致了與SPE吸附劑的固定相的疏水相互作用的強(qiáng)保留。

●洗滌：生物樣品基質(zhì)中的干擾化合物通常與感興趣的分析物共同保留在反相SPE柱/盒/板上。洗滌的目標(biāo)是選擇性地去除不需要的基質(zhì)成分，同時將感興趣的分析物(s)保留在SPE吸附劑上。在洗滌步驟中，通常首先使用純水或緩沖液來去除水溶性干擾（例如，極性化合物或鹽），對SPE吸附劑沒有親和力。隨后使用溶劑，通常是比水或緩沖液洗脫強(qiáng)度更高的甲醇水溶液，盡可能清洗樣品，但不清洗感興趣的分析物。這將需要一定程度的評價和/或優(yōu)化，在此期間，通過增加有機(jī)溶劑的百分比，對洗滌液進(jìn)行分析，以確定和/或確認(rèn)洗滌溶劑的最佳強(qiáng)度。一般來說，感興趣的分析物的logP值越高，其與反相SPE吸附劑材料的相互作用越強(qiáng)，洗滌溶劑也越強(qiáng)。一個很好的估計是，感興趣的分析物的logP值每增加一個單位，將松散地對應(yīng)于洗滌溶液中甲醇（在水中）中10%的增加10%。例如，睪酮的logP值為3.37，在洗滌溶劑中使用35%的~甲醇可以在最小的背景干擾下獲得分析物的最佳回收率。為了有效地優(yōu)化洗滌溶液，其強(qiáng)度在估計百分比（例如35%甲醇）附近的溶劑可以是一個很好的起點，將其與±10%（即25、35和45%）的甲醇包起來。

●洗脫：洗脫是為了破壞具有有機(jī)溶劑（如甲醇或乙腈）或溶劑組合的反相SPE吸附劑的官能團(tuán)之間的所有疏水相互作用。否則，可能會發(fā)生部分洗脫。部分洗脫通常與不可重復(fù)的LC-MS結(jié)果和感興趣的分析物的REC較差和不一致有關(guān)。一般來說，較高的logP值化合物需要更強(qiáng)的溶劑或溶劑組合，才能獲得最高的REC和zuidi的洗脫體積。因此，在反相SPE中，極性較低的溶劑是一種較強(qiáng)的洗脫溶劑。換句話說，選擇一個更非極性的溶劑會得到更好的結(jié)果。如果分析物(s)是堿性或酸性化合物，應(yīng)調(diào)整洗脫溶劑的pH值以給分析物(s)充電，從而進(jìn)一步減少疏水相互作用。在這種情況下，使用較弱的洗脫溶劑和/或減少洗脫體積可能是可行的。在實踐中，洗脫過程中一致和低流量通常與提高回收率和重現(xiàn)性有關(guān)。洗脫步驟被認(rèn)為是樣品清理的額外機(jī)會。使用一個非常強(qiáng)的洗脫溶劑經(jīng)常導(dǎo)致干擾的洗脫與感興趣的分析物。因此，洗脫步驟應(yīng)該使用盡可能弱的溶劑，提供分析物(s)的wanquan洗脫，但在最終洗脫液中沒有或最小的干擾化合物。在這方面，洗脫液的優(yōu)化應(yīng)通過逐步降低洗脫溶劑的強(qiáng)度，從高（如100%甲醇）到低，并監(jiān)測洗脫液中的回收率和基質(zhì)效應(yīng)。

●直接LC-MS分析洗脫液或蒸發(fā)，然后重建產(chǎn)生的殘留物進(jìn)行LC-MS分析：在反相SPE中，如果反相洗脫液比起始流動相少，則所得洗脫液可以進(jìn)行直接LC-MS分析。然而，在許多應(yīng)用中，在反相LC-MS分析之前，需要蒸發(fā)有機(jī)溶劑并使用起始流動相復(fù)溶產(chǎn)生的殘留物。