蛋白純化是生物實驗中的基礎實驗之一，隨著商業蛋白產品的價格越來越高以及實驗可能用到的蛋白量越來越大，或者課題想要的蛋白沒有商品化的蛋白可以購買，自己純化蛋白往往是一個高效而經濟的選擇。如果你對于純化實驗還沒有真正接觸過，沒關系，你可以按照以下的步驟開始你的實驗。 

PART1：對你的蛋白做一個基本的了解

在純化實驗開始之前，首先你需要對你的蛋白和純化的目標做一個初步的了解。

1、你的蛋白純化后準備用來做什么？

這個問題常常會被忽略，蛋白的用途決定了你的純化目標，進而決定你的純化路線設計。如果你對純度要求不高，往往一步純化就可以解決問題；如果你對純度要求非常高，那么往往就要用到2步和3步的純化。那我都用3步純化行不行？當然不行！純化次數越多你需要的時間和經濟成本就越高，而且隨著純化步驟的增多，蛋白量也會有一定的損耗，所以應該選擇真正適合的純化路線，可以參考下圖：

2、確定目標蛋白的性質

在純化之前，你應該會你的目標蛋白的性質有一定的了解，例如蛋白的分子量，穩定性，可溶性，等電點等等。蛋白是不是容易降解，蛋白在緩沖液里是否可以溶解，這些問題往往會影響到你整個實驗流程，所以需要多加關注。另外凝膠過濾層析需要參考蛋白的分子量；離子交換層析需要參考蛋白的等電點；疏水層析需要參考蛋白的疏水性質等。

3、確定蛋白的表達位置

并不是所有的蛋白都表達后仍停留在細胞內，在純化蛋白時要充分考慮到蛋白的位置，才能選擇到合適的樣品。如果你的蛋白是胞內蛋白，那么只要把細胞裂解掉之后就可以進行純化；如果你的蛋白是分泌蛋白，我們則需要用培養基去上樣；如果你的蛋白是膜蛋白，那么你需要使用去垢劑把蛋白從細胞膜上面溶解下來。 

PART2：選擇一個合適的表達體系（重組蛋白）

如果你是想要短時間內拿到大量的蛋白，而不是僅僅想從植物體或者動物體中分離出某些天然蛋白進行研究，那么你應該選擇先構建質粒然后在模式細胞中表達蛋白，隨著模式細胞的大量快速繁殖，你可以在短時間內拿到大量的樣品，例如下圖是使用原核表達體系重組蛋白純化的步驟（具體方法會在之后的軟文中介紹）：

在純化開始前，選擇一個合適的表達體系非常的重要，大家可以根據自己的蛋白特點以及實驗室的條件選擇，如果之前沒有做過純化可以先考慮先從原核表達起步，或者查看文獻看看其他前輩都用什么表達體系成功表達過，不同表達體系的特點如下表：

PART3：選擇合適的標簽（重組蛋白）

作為新手如果想要做重組蛋白純化，一定要在構建的載體上加上一個合適的標簽，然后再使用親和層析作為第一步純化往往可以幫你省去大量的時間和精力。標簽的選擇主要是根據蛋白的特點以及對純度的要求，新手建議可以從His標簽開始做起。

1、His標簽：標簽小，純化步驟簡便，純化條件溫和，能純化可溶性/包涵體蛋白，一般不會影響蛋白的功能結構，且可以產出大量的目標蛋白，純度和其他標簽相比略低，如果對純度不是要求特別高的情況下選擇；

2、GST標簽：洗脫條件溫和，有助于保持蛋白功能活性，適合pull-down 檢測，具有很好的線性動態范圍，但分子量較大，需要在純化后去除標簽，且不適宜變性環境；

3、MBP標簽：可以減少目標蛋白的降解，增加蛋白的表達量和穩定性，提高表達產物的水溶性，但標簽較大，對蛋白的結構和功能可能會有一定影響；

4、Strep標簽：能純化出高純度的目標蛋白，純化條件溫和，能進行變性條件下的純化。純化柱和填料的價格和其他標簽相比略高。

不同標簽的特點如下表：

PART4：選擇合適的純化方法和層析路線

前期做了諸多準備之后，我們就可以開始選擇純化方法了。常見的純化方法包括親和層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水層析、多模式層析等等。不同的純化方法可以通過目標蛋白和雜質的不同的性質進行分離和純化，有時候目標蛋白和雜質在某一個特性方面比較接近，可以考慮使用其他的特性去除雜蛋白，所以如果一種純化方法不能達到理想的純度，可以考慮使用多種方法聯用。

不同的純化方法的介紹如下：

1、親和層析：利用目標蛋白上面的標簽特性對蛋白進行純化。根據蛋白所帶的標簽選擇對應標簽的預裝柱和填料即可（例如蛋白帶有His標簽，則選擇His標簽預裝柱和填料）。親和層析具有載量高，快速分離的特點，是重組蛋白純化第一步的選擇；

2、凝膠過濾層析：利用目標蛋白和雜蛋白的分子量大小的差異進行純化。一般目標蛋白和雜蛋白的分子量相差一倍以上，可以達到比較好的純化效果。因為凝膠過濾層析的特性，它也常常被用來分離蛋白多聚體，也是在結構生物學純化中對親和層析的很好的補充；

3、離子交換層析：利用目標蛋白和雜蛋白的帶電性質的差異進行純化。在同樣PH的緩沖液中，由于目標蛋白和雜蛋白的等電點有差異，帶有的電荷正負性和帶電量都會有所不同。離子交換層析具有高分辨率的特點，可以用來很好的補充并提高樣品的純度。另外，如果樣品沒有標簽，可以選擇離子交換層析作為第一步純化；

4、疏水層析：利用目標蛋白和雜蛋白的疏水性質的差異進行純化。如果以上的方法還是無法去除雜蛋白，可以嘗試使用疏水層析；

5、多模式層析：結合了多種層析模式的特點。可以作為以上方法很好的補充。

如何搭配層析方法？

在搭配層析方法時，使用CIPP策略。盡量不要將兩種方法連續使用，盡量避免不同方法之間的樣品處理，也要在樣品純度和得率之間找到平衡。CIPP原則的純化策略如下圖：

PART 5 如何對純化后的蛋白進行檢測？

蛋白純化完之后，我們需要對純化出來的蛋白進行檢測看是否達到純化的要求。

1、檢測蛋白特異性：可以使用WB和質譜的方法；

2、檢測蛋白純度：跑SDS-PAGE膠，然后用考馬斯亮藍染色后觀察；

3、檢測蛋白量：用紫外吸光光度法，BCA法或者考馬斯亮藍法檢測蛋白濃度；

4、檢測均一性：凝膠過濾層析檢測是否有多聚體；

5、檢測活性：使用活性檢測試劑盒。

檢測示例：

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