本文要點：膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）是最致命的原發(fā)性腦腫瘤之一，但其診斷和治療仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。本文報道了中性粒細胞靶向的半導(dǎo)體聚合物納米治療平臺（SSPNiNO）用于小鼠模型中原位膠質(zhì)母細胞瘤的近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光成像引導(dǎo)的三模態(tài)治療。SSPNiNO是由兩種半導(dǎo)體聚合物分別作為NIR-II熒光探針和光熱轉(zhuǎn)換劑制成的。熱響應(yīng)一氧化氮（NO）供體和腺苷2A受體（A2AR）抑制劑共同整合到SSPNiNO中，以實現(xiàn)三重治療作用。SSPNiNO表面附著有中性粒細胞靶向配體，通過“特洛伊木馬”方式介導(dǎo)其有效遞送到原位GBM位點，從而實現(xiàn)高靈敏度的NIR-II熒光成像。在NIR-II光照下，SSPNiNO通過NIR-II光熱效應(yīng)有效地產(chǎn)生熱量，這不僅可以殺死腫瘤細胞并誘導(dǎo)免疫原性細胞死亡（ICD），還可以控制NO釋放以增強腫瘤ICD。此外，封裝的A2AR抑制劑可以通過阻斷腺苷-A2AR通路來調(diào)節(jié)免疫抑制性腫瘤微環(huán)境，從而進一步增強抗腫瘤免疫作用，顯著抑制原位GBM的進展。本研究可以為NIR-II熒光成像引導(dǎo)的有效GBM治療提供一種具有累積治療作用的多功能治療納米平臺。

活體成像

圖1. 成像引導(dǎo)下原位GBM光熱NO免疫治療的納米診療方案

在這項研究中，構(gòu)建了一種基于半導(dǎo)體聚合物（SP）的納米治療平臺，將其用于NIR-II熒光成像引導(dǎo)的原位GBM光熱NO免疫治療。中性粒細胞靶向配體唾液酸（SA）共價連接到納米治療平臺上（圖1a）提高GBM的靶向能力。中性粒細胞可以穿過BBB并滲透到膠質(zhì)瘤中，因此SA結(jié)合的納米治療平臺也可以穿過BBB，并通過結(jié)合到中性粒細胞表面來提高納米治療試劑向GBM位點的遞送效率。這些納米診療平臺包含兩個SP，分別在NIR-II激光照射下實現(xiàn)對GBM的NIR-II熒光成像以及進行NIR-II PTT。產(chǎn)生的熱殺死了腫瘤細胞，并觸發(fā)了熱反應(yīng)性NO供體釋放NO，以實現(xiàn)PTT控制的氣體治療，通過誘導(dǎo)ICD效應(yīng)光敏GBM腫瘤。這種納米治療劑遞送腺苷2A受體（A2AR）抑制劑來調(diào)節(jié)GBM的免疫抑制微環(huán)境，進一步增強抗腫瘤的免疫反應(yīng)。因此，NIR-II熒光成像引導(dǎo)的光熱NO免疫療法對GBM治療顯示出良好的效果。

圖2. 納米平臺NO和A2AR抑制劑釋放性能評價

為了研究制備的納米治療試劑的光熱性能，使用紅外熱像儀監(jiān)測了在1064nm激光照射下的納米顆粒溶液的溫度波動。SSPNNO、SPNiNO和SSPNiNO溶液的溫度在激光照射下迅速升高，并在照射6分鐘后達到峰值（55°C）（圖2a）。這些納米粒子的加熱和冷卻曲線相似，表明它們具有一致的光熱性能。納米治療的光熱效應(yīng)表現(xiàn)出對納米粒子濃度和激光功率強度的依賴性。在激光照射6分鐘后，SSPNiNO溶液的溫度分別升高到41.9、55.0和66.9°C，激光功率強度分別為0.5、1.0和1.5 W cm-2（圖2b）。當(dāng)功率強度設(shè)置為1.0 W cm-2時，SSPNiNO溶液的溫度分別在12.5、25、50和100µg mL-1的濃度下升高到32.2、43.0、55.0和65.5°C（圖2c）。在NIR-II激光器開啟/關(guān)閉的5個周期內(nèi)，SSPNNO、SPNiNO和SSPNiNO的加熱和自然冷卻曲線幾乎沒有變化（圖2d），表明它們具有良好的光熱穩(wěn)定性。這些納米粒子的光熱轉(zhuǎn)換效率約為57.4%（圖2e）。

光熱觸發(fā)S-NO鍵斷裂后，熱響應(yīng)性NO供體可以釋放NO。使用NO熒光探針確認(rèn)激光照射后NO的產(chǎn)生。NIR-II激光照射導(dǎo)致NO熒光探針的熒光強度顯著增加，這種增強的幅度與照射持續(xù)時間呈正相關(guān)（圖2f）。通過Griess試驗定量研究了光熱觸發(fā)的NO釋放。在沒有激光照射的情況下，NO的釋放可以忽略不計，但這取決于激光功率的強度和激光照射下納米粒子的濃度。0.5 W cm-2的激光不足以引發(fā)NO釋放，而與1.0 W cm-2于的激光相比，1.5 W cm-2的激光可以引發(fā)更多的NO釋放（圖2g）。在相同的激光照射條件下，SSPNiNO的濃度對NO釋放量有正比影響（圖2h）。還對A2AR抑制劑的釋放進行了評估，結(jié)果表明約60%的藥物可以在24小時內(nèi)釋放（圖2i）。

圖3. 原位GBM腦靶向效果評價及NIR-II熒光成像

使用原位GBM模型評估了納米治療診斷藥物的體內(nèi)腦靶向能力。從原位GBM的小鼠中提取大腦。與對照組和SPNiNO處理的小鼠相比，SSPNNO和SSPNiNO處理的小鼠的腦熒光強度顯著升高（圖3a，b）。此外，在腫瘤部位觀察到熒光信號。提取的大腦也被切成切片進行免疫熒光染色。盡管在SPNiNO治療組的大腦中也可以檢測到熒光信號，但在SSPNNO和SSPNiNO治療組的腦中檢測到信號（圖3c）。與SPNiNO處理組相比，SSPNNO和SSPNiNO處理組的熒光強度增加了約三倍。此外，Ce6標(biāo)記的SSPNNO和SSPNiNO的熒光信號與中性粒細胞的染色信號顯示出高度的共定位，這意味著中性粒細胞劫持在促進靶向納米治療藥物的腫瘤積聚中起著至關(guān)重要的作用。

使用納米治療儀驗證了原位GBM的NIR-II熒光成像（圖3d）。全身給藥后，GBM位點的熒光逐漸升高，SSPNNO、SPNiNO和SSPNiNO注射的小鼠在24小時時也達到峰值（圖5e）。此時，注射SSPNNO和SSPNiNO的小鼠的GBM位點信號比注射SPNiNO的小鼠強得多。定量分析顯示，與注射SPNiNO的小鼠相比，注射SSPNNO和SSPNiNO的小鼠原位GBM位點的NIR-II熒光強度增加了約2.0倍（圖3f）。這驗證了使用SSPNNO和SSPNiNO對原位GBM進行靶向NIR-II熒光成像的可能性。

圖4. 小鼠原位GBM的體內(nèi)療效評價

原位C6-GBM攜帶Balb/c小鼠模型已用于體內(nèi)抗腫瘤作用評估。使用原位螢光素酶（Luc）-C6-GBM小鼠模型評估了納米治療劑的體內(nèi)抗腫瘤療效（圖4a）。用NIR-II激光照射原位GBM位點以介導(dǎo)體內(nèi)抗腫瘤治療，并記錄腫瘤的溫度。在NIR-II照射10分鐘后，注射SSPNNO和SSPNiNO的小鼠的腫瘤溫度升高了≈27.0°C，比NIR-II激光照射下注射SPNiNO的小鼠高10°C。如圖4b所示，與對照組相比，注射SSPNiNO和NIR-II激光照射（10分鐘）顯示出顯著的腫瘤生長抑制作用，這可以從腫瘤部位Luc信號強度的顯著降低中得到證明。相比之下，SPNiNO+激光和SSPNNO+激光僅顯示出部分抑制作用。SPNiNO+激光、SSPNNO+激光和SSPNiNO+激光組腫瘤部位的生物發(fā)光強度總體上低于PBS、游離A2AR抑制劑和SSPNiNO組（圖4c），表明基于納米治療的組合療法具有抗腫瘤療效。SSPNiNO+激光組在治療18天后，腫瘤部位的生物發(fā)光強度。還通過測量小鼠的存活時間來評估抗GBM的療效。在對照組中，C6-GBM模型的中位生存期僅為23天，而游離A2AR抑制劑治療將中位生存時間略微增加到24天（圖6d）。相比之下，SPNiNO+激光、SSPNNO+激光和SSPNiNO+激光組的存活時間延長。在用NIR-II激光照射SPNiNO和SSPNNO后，60%的攜帶GBM的小鼠在接種腫瘤38天后仍然存活。SSPNiNO+激光組在整個觀察期內(nèi)，所有攜帶GBM的小鼠均存活。攜帶GBM的小鼠的體重在腫瘤生長過程中逐漸下降。SSPNiNO+激光組的體重減輕最小，表明其抗GBM療效。

組織學(xué)染色分析以進一步研究抗GBM療效。在PBS、游離A2AR抑制劑和SSPNiNO組顯示出完整的腫瘤細胞形態(tài)，沒有壞死（圖4e）。SPNiNO+激光、SSPNNO+激光和SSPNiNO+激光組腫瘤明顯消融，這些組中檢測到腫瘤細胞壞死。SSPNiNO+激光組細胞壞死程度，腦內(nèi)幾乎未觀察到腫瘤細胞。Ki-67染色顯示癌癥細胞的增殖能力， SSPNiNO+激光組的信號最弱（圖4e）。結(jié)果表明，SSPNiNO在NIR-II激光照射下可以達到的抗GBM療效。

圖5. 體內(nèi)ICD誘導(dǎo)和腺苷代謝評估

研究治療后的ICD效果。在SPNiO+激光、SSPNO+激光和SSPNiNO+激光組中，綠色熒光信號相比對照組顯著增加（圖5a）。在SSPNO+激光和SSPNiNO+激光組中，與PBS組相比，HMGB1熒光強度分別增加了1.8倍和2.2倍（圖5b）。SSPNO+激光和SSPNiNO+激光組的CRT染色信號強度分別增加了6.1倍和7.4倍（圖5c）。因此，與PBS組相比，SSPNO+激光組腫瘤中的ATP水平分別增加了1.8倍和2.2倍（圖5d）。然而，SSPNiNO和游離A2AR抑制劑組的ATP水平?jīng)]有顯著升高。

ATP可以在腫瘤微環(huán)境中被外核苷酸酶水解為免疫抑制腺苷，可以通過作用于各種免疫細胞上表達的A2AR，發(fā)揮免疫抑制作用。與PBS對照組相比，SSPNO+激光和SSPNiNO+激光組的腫瘤中腺苷水平分別增加了約1.4倍和1.6倍（圖5e）。免疫熒光染色用于驗證腺苷免疫抑制腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)。這揭示了這些納米治療劑釋放A2AR抑制劑以阻斷腺苷與A2AR的結(jié)合（圖5f）。NIR-II PTT和NO氣體治療觸發(fā)了腫瘤細胞的ICD，這可以將冷GBM轉(zhuǎn)化為熱表型，以改善效應(yīng)T細胞向腫瘤組織的浸潤。此外，A2AR抑制可以逆轉(zhuǎn)腺苷對浸潤T細胞的免疫抑制作用，從而協(xié)同增強免疫反應(yīng)，提高抗腫瘤療效。

圖6. 體內(nèi)抗腫瘤免疫反應(yīng)的評估

為了驗證體內(nèi)增強的免疫反應(yīng)，研究了脾臟、引流淋巴結(jié)和腫瘤中的免疫細胞。如圖6a所示，在各種治療方案后，引流淋巴結(jié)中樹突狀細胞(DCs)的百分比有所增加。在SPNiNO+激光、SSPNNO+激光和SSPNiNO+激光組中，DCs百分比分別增加到17.8%、16.8%和22.1%（圖6b）。在SSPNiNO+激光組中觀察到CD4 T細胞（33.4%）（圖6d）。同樣，在應(yīng)用納米治療和NIR-II激光照射后，CD8 T細胞水平顯著上升（圖6e，f）。值得注意的是，SSPNiNO+激光組的DC、CD4 T細胞和CD8 T細胞總體上高于SSPNNO+激光組，這表明A2AR抑制劑對全身免疫功能具有調(diào)節(jié)作用。

還對原位GBM腫瘤進行了免疫熒光CD4、CD8和Foxp3染色，以評估局部免疫反應(yīng)。SPNiNO+激光、SSPNNO+激光和SSPNiNO+激光組與PBS、游離A2AR抑制劑和SSPNiNO組相比，CD4和CD8的熒光信號明顯更強（圖6g），在SSPNO+激光、SPNiNO+激光和SSPNiNO+激光組中，F(xiàn)oxp3染色信號減弱。與對照組相比，SSPNO+激光、SSPNiNO+激光和SSPNiNO+激光的Treg細胞分別減少了56.0%、75.0%和93.0%（圖S35，支持信息）。這些結(jié)果表明，在SSPNiNO+激光組的原位GBM腫瘤中，CD4和CD8T細胞，但Treg細胞，表明免疫效果。NIR-II PTT和NO氣體治療的組合誘導(dǎo)了增強的ICD效應(yīng)，以激活免疫反應(yīng)，與A2AR抑制劑協(xié)同作用，實現(xiàn)免疫反應(yīng)增強。

在本研究中，構(gòu)建了含有兩種SP，一種熱反應(yīng)性NO供體和A2AR抑制劑的中性粒細胞靶向納米治療平臺（SSPNiNO），用于NIR-II熒光成像引導(dǎo)的原位GBM聯(lián)合治療。SSPNiNO的表面被一種中性粒細胞靶向配體修飾，這使得它們能夠粘附到中性粒細胞上，穿過BBB，并有效遞送到原位GBM位點。兩種SP的摻雜實現(xiàn)了NIR-II熒光成像和PTT。在NIR-II激光照射下，SSPNiNO可以將光能轉(zhuǎn)化為熱量，導(dǎo)致局部溫度升高，熱響應(yīng)性NO供體釋放NO。因此，在將SSPNiNO尾靜脈注射到原位攜帶GBM的小鼠體內(nèi)后，NIR-II激光可以遠程觸發(fā)原位NO釋放和光熱效應(yīng)，從而誘導(dǎo)ICD效應(yīng)和免疫“冷”腫瘤向“熱”腫瘤的轉(zhuǎn)變。此外，SSPNiNO遞送A2AR抑制劑以阻斷腺苷途徑的抑制，進一步增強免疫效果以原位GBM。目前，這是使用聚合物納米診療平臺，在NIR-II熒光成像引導(dǎo)的原位GBM PTT-NO-免疫治療中的開創(chuàng)性研究。

參考文獻

Liu J, Cheng D, Zhu A, et al. Neutrophil‐Targeting Semiconducting Polymer Nanotheranostics for NIR‐II Fluorescence Imaging‐Guided Photothermal‐NO‐Immunotherapy of Orthotopic Glioblastoma[J]. Advanced Science, 2024: 2406750.