摘要手持式拉曼光譜儀能夠穿透透明和不透明的包裝容器來(lái)鑒別原輔料。本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)展示了使用基于空間位移拉曼光譜 (SORS) 的手持式 Agilent Vaya 拉曼光譜原輔料鑒定驗(yàn)證系統(tǒng)，穿透透明玻璃和白色不透明聚乙烯容器對(duì) mRNA 脂質(zhì)納米顆粒 (LNP) 組分進(jìn)行化學(xué)身份驗(yàn)證和測(cè)試。

前言脂質(zhì)納米顆粒 (LNPs) 對(duì)于各種治療藥物至關(guān)重要[1]。它們被用作藥物遞送系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)有效的靶向有效載荷遞送。最近，它們已被用作  疫苗的 mRNA 載體。核酸 LNP 制劑通常由脂質(zhì)和非脂質(zhì)賦形劑構(gòu)成。兩種賦形劑類型在疫苗的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)染有效性和安全性中起到重要作用[2]。因此，評(píng)估LNP 制備中所用原輔料的化學(xué)組成和純度至關(guān)重要，因?yàn)樗鼈冎苯佑绊懽罱K產(chǎn)品質(zhì)量。強(qiáng)制性現(xiàn)行藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范原輔料鑒定測(cè)試或驗(yàn)證結(jié)合簡(jiǎn)化的檢測(cè)，可有效解決這一質(zhì)量控制需求。拉曼光譜現(xiàn)在是鑒定測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。拉曼光譜可對(duì)原輔料進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)身份驗(yàn)證。SORS 是一種專門的技術(shù)，可以準(zhǔn)確鑒定不透明或透明表面下方的材料，無(wú)需打開樣品瓶或容器[3]。在本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)中，使用 Vaya 拉曼光譜系統(tǒng)（基于 SORS 的手持式拉曼光譜儀）分析 mRNA LNP 制備中所用的幾種市售脂質(zhì)和非脂質(zhì)賦形劑。Vaya 可以穿透透明和不透明容器鑒定原輔料。

實(shí)驗(yàn)部分三(羥甲基)氨基甲烷 (Tris)、檸檬酸、乙腈、甲醇、乙醇、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、甘露醇和山梨醇均來(lái)自 Sigma-Aldrich。1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿 (DSPC)、1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000 (DMG-PEG 2000) 和膽固醇由MedChemExpress 提供。所有賦形劑均在各自原始容器中進(jìn)行分析（納米顆粒組分與相關(guān)容器的確切組合見圖 1）。對(duì)每種脂質(zhì)創(chuàng)建身份驗(yàn)證方法，以展示利用 Vaya 穿透玻璃樣品瓶對(duì) LNP 組分的區(qū)分。使用內(nèi)置方法開發(fā)向?qū)ч_發(fā)方法。用戶僅需提供容器類型信息，Vaya 會(huì)自動(dòng)設(shè)置所有其他采集參數(shù)。在采集 SORS 光譜前進(jìn)行了性能確認(rèn)測(cè)試。使用每種身份驗(yàn)證方法生成本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)中提供的光譜數(shù)據(jù)。自動(dòng)化基線校正是 Vaya 常規(guī)分析方案的組成部分，除此之外，沒(méi)有進(jìn)行額外的數(shù)據(jù)處理。

結(jié)果與討論脂質(zhì)和非脂質(zhì)賦形劑的類型脂質(zhì)賦形劑和非脂質(zhì)賦形劑（如緩沖液組分和冷凍保護(hù)劑）用于基于核酸的 LNP 產(chǎn)品。圖 1 顯示了本研究中所用的四類化學(xué)品（脂質(zhì)、緩沖液、溶劑和糖基冷凍保護(hù)劑）及其相應(yīng)的容器類型。脂質(zhì)脂質(zhì)為 LNPs 的結(jié)構(gòu)單元。圖 2 顯示了拉曼光譜的疊加圖，以及 Vaya 如何輕松區(qū)分聚乙二醇化、離子和固醇類脂質(zhì)。拉曼譜帶歸屬確認(rèn)脂質(zhì)中存在長(zhǎng)烴鏈[4]。1440 cm-1 處的譜帶來(lái)自 CH2 和 CH3 的變形振動(dòng)，而 1673 cm-1 處的譜帶來(lái)自膽固醇中存在的 C=C 的伸縮振動(dòng)。在 DSPC 中，949 cm-1 處的譜帶對(duì)應(yīng)于 PO 伸縮振動(dòng)。1700 cm-1 處的譜帶來(lái)自 DSPC 和DMG-PEG 2000 脂質(zhì)中的 C=O 伸縮振動(dòng)。

緩沖液在 LNP 制備期間使用了各種類型的緩沖液。圖 3 顯示了三種生物緩沖液類型的拉曼光譜疊加圖及相應(yīng)歸屬。基于所有三幅光譜中顯示的不同拉曼譜帶，可以在 LNP 制備之前鑒定這些緩沖液。在 tris 光譜中，1500–1700 cm-1 區(qū)域的譜帶與 N-H彎曲相關(guān)。對(duì)于 HEPES，1046 cm-1 處的譜帶來(lái)自 SO3 伸縮振動(dòng)。在檸檬酸中，1700 cm-1 處的譜帶來(lái)自 C=O 伸縮振動(dòng)。

有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑在 LNP 制備中起重要作用。圖 4 顯示了三種溶劑類型的拉曼光譜疊加圖及相應(yīng)歸屬。這些溶劑的光譜顯示其譜帶存在明顯差異。甲醇在 1035 cm-1 處的強(qiáng)譜帶對(duì)應(yīng)于 C-O 伸縮振動(dòng)。乙醇光譜在 882 cm-1 處有一個(gè)強(qiáng)譜帶，對(duì)應(yīng)于 C-C伸縮振動(dòng)，在 1050 和 1096 cm-1 處有兩個(gè)小峰，分別對(duì)應(yīng)于C-O 伸縮振動(dòng)和 CH3 面內(nèi)搖擺振動(dòng)。乙腈在 921 cm-1 處有一條強(qiáng)譜帶，表明為 C-C 骨架振動(dòng)模式。

冷凍保護(hù)劑在配制步驟中使用冷凍保護(hù)劑延長(zhǎng) mRNA LNP 保質(zhì)期。各種糖的拉曼光譜及其相應(yīng)的歸屬如圖 5 所示。疊加圖展示了如何用每種糖的光譜將其與其他糖區(qū)分開來(lái)。在蔗糖光譜中，641.42 和 849.57 cm-1 處的信號(hào)分別是扭轉(zhuǎn) CH2 和C-C 伸縮振動(dòng)的結(jié)果。麥芽糖在 850.96 cm-1 處的信號(hào)與 CH變形振動(dòng)相關(guān)。海藻糖在 841.25 cm-1（C-O-C 變形振動(dòng)）、910.63 cm-1（C-O 伸縮振動(dòng)）、1121.57 cm-1（C-C 伸縮振動(dòng)）和 1454.82 cm-1（CH2 面外搖擺振動(dòng)和 C-C 伸縮振動(dòng)）處出現(xiàn)譜帶。分別在 878 和 1050 cm-1 處發(fā)現(xiàn)甘露醇和山梨醇的同相 C-C-O 伸縮振動(dòng) (878 cm-1) 和異相 C-C-O 伸縮振動(dòng)(1050 cm-1)。

結(jié)論本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)已經(jīng)證明，Agilent Vaya 手持式拉曼光譜系統(tǒng)可用于分析和鑒定 mRNA LNP 制劑中所用的脂質(zhì)和非脂質(zhì)賦形劑。本文所用的技術(shù)可以直接測(cè)量不同容器（透明和棕色玻璃瓶以及聚乙烯材質(zhì)）中的原輔料。借助 Vaya，生物藥物產(chǎn)品的原輔料鑒定測(cè)試將易于推行并可直接在倉(cāng)庫(kù)的檢疫區(qū)域進(jìn)行。使用 Vaya 時(shí)，無(wú)需再進(jìn)行采樣、無(wú)需配備采樣間，也無(wú)需再打開一級(jí)或二級(jí)容器。