3型固有淋巴細胞（ILC3）是腸道免疫領域的關鍵參與者，在腸道淋巴組織發(fā)育、屏障完整性、耐受菌群和飲食抗原等方面發(fā)揮關鍵作用。ILC3 對周圍的微環(huán)境高度敏感。越來越多的研究已經確定了ILC3和腸道上皮之間的許多信號模塊，這些模塊在各種穩(wěn)態(tài)和炎癥過程中都很重要。這些研究都集中在ILC3信號對上皮細胞的影響上，其中白細胞介素-22（IL-22）在上皮細胞的多效性、環(huán)境依賴性和亞群特異性調控中處于中心位置。然而，ILC3 可以產生其他細胞因子和信號因子，可能與 IL-22 協(xié)同調節(jié)上皮細胞。此外，上皮-ILC3信號模塊也可能是雙向的，如上皮-ILC3相互作用在炎癥性疾病（如炎癥性腸病IBD）中的變化。

為了探索 ILC3-上皮腸道的相互作用，倫敦國王學院宿主-微生物相互作用中心、曼徹斯特大學生物醫(yī)學與健康學院及瑞典哥德堡大學醫(yī)學生物化學和細胞生物學系的研究團隊在小鼠上皮小腸類器官（SIO）和小腸固有層（SILP）衍生的 ILC3 之間采用了體外共培養(yǎng)系統(tǒng)，用于描述 ILC3 衍生的 IL-22 對腸上皮細胞再生的影響并驗證與神經肽激活的 ILC3 共培養(yǎng)后腸上皮細胞中 IL-22 靶基因的上調。該研究旨在確定 ILC3 和腸道上皮之間的新信號轉導模塊，并表征這些通路對上皮和 ILC 區(qū)室的影響。研究成果發(fā)表在 Mucosal Immunology 期刊題為“Bi-directional signaling between the intestinal epithelium and type-3 innate lymphoid cells regulates secretory dynamics and interleukin-22”。

首先，為了辨別 ILC3 對上皮表型的影響，使用 ILC3 的異質亞群（包括 CCR6- NKp46+/- 亞群和 CCR6+ LTi 樣細胞）建立 SIO 共培養(yǎng)，以創(chuàng)建 ILC3 區(qū)室的代表性模型，比較了從SIO中分離出的腸上皮細胞（IEC）與ILC3共培養(yǎng)（IEC + ILC3）與在相同培養(yǎng)條件下不添加ILC3（IEC ONLY）的IEC的轉錄組。GSEA分析顯示 IEC + ILC3 中分泌型杯狀細胞和潘氏細胞特征顯著富集，幾種典型杯狀細胞（例如 Spedf、Muc3、Muc2）和潘氏細胞（Defa23、Mmp7、Lyz）標志物的表達增加。這些數(shù)據(jù)表明，ILC3 促進了 SIO 模型系統(tǒng)中某些分泌型腸上皮特征的富集。

然后，實驗試圖表征這些分泌細胞如何影響共培養(yǎng)中的 ILC3 （圖1 A），生成了富含潘氏細胞（PAN）和杯狀細胞（GOB）的SIO方案。NCR+ ILC3 亞群是 IL-22 的重要生產者，且腸黏膜中IL-22 + ILC3減少與IBD的發(fā)生相關。與GOB共培養(yǎng)后，觀察到與SIO或PAN共培養(yǎng)相比，NKp46+ ILC3的比例顯著增加（圖1 B、C）。與 SIO 相比，GOB 共培養(yǎng)后 ILC3 中 NKp46 的表達更高（圖1 D）。然后將 NKp46- 和 NKP46+ ILC3 分別接種到 SIO 或 GOB 共培養(yǎng)物中，發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)的SIO共培養(yǎng)相比，GOB僅增加了NKp46- ILC3共培養(yǎng)物中NKp46+ ILC3的比例，而沒有增加NKp46 + ILC3 中的比例（圖1 E）。這表明，GOB促進NKp46^low 或 NKp46- ILC3中NKp46的表達。

鑒于 GOB 在共培養(yǎng)中維持 NKp46+ ILC3 比例的強大能力，因此表征杯狀細胞是否影響 ILC3 細胞因子譜。與 IL-22 結合時，ILC3 以亞群和刺激依賴性方式產生 IL-17 和 IFNγ。在非極化刺激條件下，與SIO共培養(yǎng)相比，GOB增加了IL-22+ 的比例，但沒有增加IL-17+ 或IFNγ+ ILC3（圖1 F-H），且IL-22在與GOB共培養(yǎng)的ILC3中表達增加（圖1 G）。

然后評估了杯狀細胞誘導的IL-22對上皮細胞的可能反饋。與SIO相比，與GOB共培養(yǎng)的ILC3中Il22轉錄物增加。同時，從 ILC3 共培養(yǎng)物中分離的 SIO 和 GOB IEC 中 IL-22 靶基因 Reg3g 的表達更高，且在受刺激的 GOB-ILC3 共培養(yǎng)中，Reg3g 在 IEC 中的表達最高（圖1 I）。這些結果表明，杯狀細胞維持NKp46+ 的表達并促進IL-22的產生，從而反饋上調上皮保護屏障成分。

為了確定杯狀細胞對 ILC3 表型的調控是否由可溶性因子介導，在物理分離類器官和 ILC3 的transwell 系統(tǒng)中建立了共培養(yǎng)（圖1 J）。與基質共培養(yǎng)相比，SIO 和 GOB 共培養(yǎng)中 ILC3 的 IL-22 表達降低（圖1 K），表明物理接觸在上皮介導的ILC3衍生的IL-22調節(jié)中的重要性。通過來自mCherry-MUC2小鼠的 RORγtGFP ILC3和SIO 共培養(yǎng)的實時成像，檢測到ILC3和Muc2+ 細胞的共定位（圖1 L）。這些數(shù)據(jù)表明，ILC3 可能在體內與杯狀細胞發(fā)生物理相互作用。

圖1    與富含SIO的杯狀細胞（GOB）共培養(yǎng)維持NKp46的表達，并增加ILC3中IL-22的產生。

由于Notch信號依賴于物理相互作用，實驗假設系統(tǒng)中ILC3的上皮調節(jié)是由Notch通路驅動的。Met分析證實杯狀細胞富集 Notch 配體 Delta-Like-Canonical-Notch-Ligand （Dll）1 和 Dll4 （圖2 A-C）。與常規(guī) SIO 相比，GOB 中 Dll1 和 Dll4 的表達增加 （圖2 D-F），Dll1 在 GOB 中富集，但未在 PAN中富集，這為 PAN 和 GOB 共培養(yǎng)中 IL-22 上調的差異提供了潛在機制（圖1 B-D）。

接下來，為了驗證杯狀細胞衍生的Notch配體在調節(jié)ILC3衍生的IL-22中的重要性，在共培養(yǎng)前將GOB中Dll敲低（圖2 G），發(fā)現(xiàn)GOB中Dll1+ IEC的比例和Dll1蛋白表達的折疊變化降低（圖2 H-J），重要的是，從這些培養(yǎng)物中分離的 ILC3 的 Il22 表達顯著降低（圖2 K）。這些數(shù)據(jù)表明，上皮細胞，特別是杯狀細胞，是腸道中Notch配體的來源，以調節(jié)ILC3。

轉錄因子 T-bet 是 NKp46+ ILC3 亞群的發(fā)育和維持所必需的，雖然尚未確定，但Notch和T-bet在調節(jié)NCR+ ILC3方面存在交集。為了確定 T-bet 在Notch1介導的GOB上調IL-22中的作用，分析Notch1受體激活后產生的裂解的Notch1胞內結構域（NICD），量化了Notch1活性信號。結果表明，與GOB共培養(yǎng)時，T-bet+ ILC3中NICD+ IL-22+ 雙陽性細胞的增加，但在T-bet+ ILC3中沒有增加（圖2 L-M）。通過GOB共培養(yǎng)，IL-22的蛋白表達和裂解的NICD豐度在T-bet+ ILC3中特異性增加（圖2 N-O）。這些結果強調了Notch通路在調節(jié)ILC3功能中的關鍵亞群特異性作用，其中T-bet+ ILC3亞群對杯狀細胞衍生的Notch信號敏感，并通過IL-22 的生成作出響應（圖2 P）。

圖2    杯狀細胞富集SIO （GOB）衍生的Notch配體Dll1在調節(jié)T-bet+ ILC3中起重要作用。

最后，研究人員考慮了 Notch 介導的 ILC3 和上皮細胞之間的相互作用對最初在轉錄數(shù)據(jù)集中觀察到的分泌型細胞偏向分化的可能貢獻。Notch信號對腸上皮中分泌細胞和吸收細胞譜系的發(fā)育很重要，Notch的失活可抑制轉錄因子Atoh1。對小鼠 Atoh1 靶組的GSVA顯示，IEC + ILC3 中 Atoh1 和 Atoh1 靶基因顯著富集（圖3 A-C），在沒有 ILC3 的情況下將 IL-22 補充到類器官培養(yǎng)物中未發(fā)現(xiàn)相同程度的特征。用 10 ng/ml IL-22 處理 SIO 24 小時后，未發(fā)現(xiàn) Atoh1、Muc2、Tff3 或Lyz1 的 RT-qPCR 上調，但Fut2 和 Reg3g 上調（圖3 D）。這與最近使用細胞因子添加到SIO來描述杯狀細胞對IL-13和IL-22的二元反應的發(fā)現(xiàn)是一致的。因此，實驗假設了一種機制，即 ILC3 可能通過結合祖細胞上皮群體中的 Notch 配體來調節(jié)控制分泌型與吸收型分化（圖3 E）。

圖3     ILC3上調Notch介導的分泌譜系轉錄因子Atoh1的上皮轉錄特征。

圖4     圖形概要

總之，該研究報告，ILC3 誘導腸上皮細胞的全局轉錄變化，驅動分泌型杯狀細胞特征的富集。研究發(fā)現(xiàn)富含杯狀細胞的 SIO 促進 NKp46+ ILC3 和 IL-22 的表達，這可以反饋誘導 IL-22 介導的上皮轉錄特征。然而，該系統(tǒng)中 ILC3 的上皮調節(jié)是接觸依賴性的，并證明了上皮 Delta 樣典型Notch-配體（Dll）通過亞群特異性 Notch1 介導的 T-bet+ ILC3 激活，在驅動 ILC3 產生 IL-22 中的作用。最后，在SIO-ILC3共培養(yǎng)中通過干擾Notch配體-受體動力學，ILC3似乎上調上皮Atoh1，從而影響分泌譜系決定。研究概述了腸上皮和ILC3之間的兩個互補的雙向信號模塊，它們可能與腸道穩(wěn)態(tài)和疾病有關。此外，該研究結果進一步證明了類器官是研究上皮免疫相互作用的有力工具。該系統(tǒng)提供的精細實驗控制量可以繼續(xù)發(fā)展我們對上皮-ILC 相互作用的詳細理解，以概述可能支持腸道穩(wěn)態(tài)并在臨床相關疾病中失調的機制。

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Impact Factor    7.9

Online ISSN: 1935-3456Linking ISSN: 1933-0219

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