摘要：本應用簡報介紹了用于分析煙草中農藥殘留的多組分分析方法的開發與優化。該方法包括使用 Agilent Bond Elut QuEChERS EN 萃取試劑盒進行樣品萃取，隨后使用Agilent Captiva 增強型基質去除-低色素含量干性基質 (EMR-LPD) 進行通過式凈化，然后進行 LC/MS/MS液質聯用和 氣質聯用儀GC/MS/MS分析。新開發的方法在分析煙草中的大量農藥時表現出高基質去除率和可接受的目標分析物定量結果，不合格率非常低。在煙草的分析中，300 多種適合 LC 和 GC 分析的農藥獲得了優異的方法定量結果，超過 95%的目標分析物平均回收率為 70%–120%，且超過 98% 的目標分析物平均 RSD 低于20%。通過干燥殘渣重量進行基質去除評估，結果表明，煙草粉共萃取物的去除率約為 60%。通過式凈化被證明是一種省時省力的簡單方法。

前言煙草是一種重要經濟作物，消費范圍遍及全球。種植者為了保持作物質量和產量，會在種植、儲存和運輸過程中施用農藥防治病蟲害。公眾因消費煙草而暴露于農藥的問題已經在全球范圍內引起高度關注。因此，監測煙草中的農藥殘留需要采用可靠的分析方法進行安全性評估，以符合 CORESTA 規定的指導性殘留量 (GRLs)[1]。煙草是一種復雜的干性基質，含有多種成分，包括碳水化合物、蛋白質、脂肪酸、蠟質、色素、生物堿和尼古丁[2,3]。復雜的基質使樣品前處理難以同時實現多組分農藥萃取和基質去除。常用的樣品前處理方法包括使用 QuEChERS 或改進QuEChERS 萃取，隨后進行分散式 SPE 凈化[4,6]。配備 Carbon S 小柱的 Captiva EMR 采用通過式凈化方法進行快速高效的樣品基質去除。Captiva EMR-普通色素干性基質(EMR-GPD) 和 EMR-低濃度色素干性基質 (EMR-LPD) 小柱尤其適用于復雜的植物干性基質。兩種小柱均包含安捷倫吸附劑 Carbon S 和 Captiva EMR-Lipid，并以優化的配方與N-丙基乙二胺 (PSA) 和 C18 混合。Captiva EMR-Lipid 吸附劑可提供高選擇性和高效脂質去除，而 PSA 吸附劑則可高效去除脂肪酸和其他酸，Carbon S 吸附劑可高效去除色素，EC-C18 可進一步凈化疏水基質。混合配方經過精心開發和優化，為具有不同水平色素成分的復雜干性基質提供了更出色的基質去除率與目標分析物回收率之間的平衡。對于普通色素干性基質，通常推薦使用 Captiva EMR-GPD，而對于低濃度色素干性基質，則建議使用 Captiva EMR-LPD。本研究開發出一種在 QuEChERS 萃取后使用 Captiva EMR-LPD通過式凈化的樣品前處理方法，用于對煙草中的 300 多種常見農藥進行 LC/MS/MS 和 GC/MS/MS 分析。還對該新型凈化方法與傳統的分散式 SPE (dSPE) 凈化進行了全面比較。

實驗部分化學品與試劑農藥標準品和內標 (IS) 以混標儲備液的形式購自安捷倫科技公司（貨號 5190-0551）和 Restek (Bellefonte, PA, U.S.A.)，或以單標儲備液或粉末的形式購自 Sigma-Aldrich (St Louis, MO,U.S.A.)。HPLC 級乙腈 (ACN) 購自 Honeywell (Muskegon, MI,U.S.A.)。試劑級乙酸、乙酸銨和氟化銨也購自 Sigma-Aldrich。溶液與標準品用 1:1 ACN/水或 ACN 配制濃度為 10 µg/mL 的標樣加標溶液（包括 LC 和 GC 標樣加標溶液）和 IS 加標溶液，并在 -20 °C的冰箱中保存。標樣和 IS 加標溶液使用前在室溫下解凍并渦旋，使用后重新放回原處儲存。在 990 mL 乙腈中加入 10 mL 冰乙酸，制備含 1% 乙酸的乙腈萃取溶劑，并于室溫下儲存。

儀器與材料LC/MS/MS 研究使用 Agilent 1290 Infinity 液相色譜與 Agilent6490 三重四極桿 LC/MS 的聯用系統。1290 Infinity 液相色譜系統包括 Agilent 1290 Infinity 二元泵 (G4220A)、Agilent 1290Infinity 自動進樣器 (G4226A) 和 Agilent 1290 Infinity 柱溫箱(G1316C)。聯用的 6490 三重四極桿 LC/MS 配備安捷倫噴射流電噴霧離子源。采用 Agilent MassHunter Workstation 軟件進行數據采集和分析。GC/MS/MS 研究使用 Agilent 8890 GC 與 Agilent 7000E 三重四極桿 GC/MS 系統 (GC/TQ)。GC 配置有 Agilent 7693A 自動液體進樣器 (ALS) 和 150 個瓶位的樣品盤。系統使用多模式進樣口 (MMI)。使用由安捷倫吹掃 Ultimate 接頭 (PUU) 連接的兩根相同的 15 m 柱實現柱中反吹配置，并由 Agilent 8890 氣路反吹模塊 (PSD) 控制。有關 GC/TQ 配置，請參見 Andrianova 撰寫的安捷倫應用簡報[7]。在動態 MRM (dMRM) 模式下采集數據。采集方法為保留時間鎖定法，以匹配 Agilent MassHunter農藥與環境污染物 MRM 數據庫 (P&EP 4) 中的保留時間，該數據庫用于無縫創建 MS 方法。采用 MassHunter Workstation軟件進行數據采集和分析。

樣品前處理中使用的其他儀器包括：Centra CL3R 離心機(Thermo IEC, MA, U.S.A.)、Geno/Grinder (SPEX, NJ, U.S.A.)、Multi Reax 試管振蕩器 (Heidolph, Schwabach, Germany)、移液管和重復用移液器 (Eppendorf, NY, U.S.A.)、安捷倫正壓48 孔處理裝置 (PPM-48)（貨號 5191-4101）、Agilent BondElut QuEChERS EN 萃取試劑盒（貨號 5982-5650）、AgilentCaptiva EMR-LPD 小柱，6 mL（貨號 5610-2092）、AgilentBond Elut QuEChERS EMR-Lipid 除脂萃取鹽包、3.5 g 無水MgSO4（貨號 5982-0102）以及陶瓷均質子，50 mL 管，100/包（貨號 5982-9313）。

儀器條件表 1 列出了 LC/MS/MS 條件。有關目標分析物的動態多反應監測 (dMRM) 參數，請參見 Zhao 的應用簡報[8]。表 2 列出了GC/MS/MS 條件。有關目標分析物的 dMRM 參數，請參見Agilent MassHunter 農藥與環境污染物 MRM 數據庫 (P&EP 4)（部件號 G9250AA）。圖 1 顯示了采用 QuEChERS EN 萃取，然后用 Captiva EMR-LPD凈化制備的濃度為 100 ng/g 的加標煙草粉樣品中目標農藥的典型 MRM 色譜圖。

樣品前處理煙草購自當地市場，將煙葉碎片取出并研磨成粉末。稱取 1 g煙草粉置于 50 mL 離心管中。向每份樣品中加入 5 mL 水。然后將樣品渦旋 20 分鐘，對干性基質進行充分水化和平衡。按照 QuEChERS EN 方法對樣品混合物進行萃取。使用 CaptivaEMR-LPD 6 mL 小柱凈化粗提物，并用無水 MgSO4 干燥。僅當使用 GC 檢測以及聯合 LC 和 GC 檢測時，才需要干燥步驟。當僅使用 LC 檢測時，可以省去干燥步驟。最終的樣品洗脫液可以直接進樣或進一步用水或緩沖液稀釋。然后樣品可直接進樣至 GC/MS/MS，或在 LC/MS/MS 檢測之前進一步稀釋。詳細的樣品前處理流程如圖 2 所示。從煙草粉中目標分析物濃度到最終經樣品萃取和基質凈化的煙草粉提取物，整個樣品前處理過程的稀釋倍數為 10 倍。

方法性能評估根據以下幾個方面對開發的樣品前處理方法進行了評估：煙草粉中的基質去除率，目標分析物回收率、重現性和基質效應，基質匹配校準曲線線性和定量限 (LOQs)。為評估回收率、重現性和基質效應，使用煙草粉制備 20 ng/g 和 100 ng/g 的預加標質量控制 (PR-QC) 樣品，一式六份，對應的萃取后樣品粗提物中的濃度為 2 ng/mL 和 10 ng/mL。然后使用開發的方法制備加標樣品和基質空白樣品。在用水稀釋之前，在基質空白萃取物中制備后加標 QCs (PO-QC)，對應于 2 ng/mL 和10 ng/mL。以 2 ng/mL 和 10 ng/mL 的濃度直接對試劑空白（含 1% 乙酸的乙腈）加標，制備溶劑標樣，然后用水適當稀釋。每種 QC 平行制備 6 份。使用 PR-QCs 和 PO-QCs 中相應

目標分析物的峰面積比計算目標分析物回收率。使用 PR-QCs中的峰面積通過計算 RSD 確定樣品前處理方法的重現性。使用 PO-QCs 和溶劑標樣中相應目標物的峰面積比計算目標物基質效應。通過在煙草粉基質空白提取物中以 1、2、5、10、50、100、250、400 和 500 ng/g 的濃度進行后加標（在煙草中對應的濃度為 10–5000 ng/g），對基質匹配校準曲線線性和 LOQs 進行評估。由保留時間和 MRM 離子對確定分析物鑒定、確認和定量結果。

結果與討論方法開發與優化煙草葉粉呈黃色至淺棕色。QuEChERS 萃取后的粗提物呈淺黃色，因此 Captiva EMR-LPD 是一個合適的選擇。研磨后的煙草粉非常干燥，因此每 1 g 干粉需要加入 5 mL 水性緩沖液，然后通過渦旋進行較長時間的混合（20–30 分鐘）。由此得到水化的均質物。