簡(jiǎn)介

ω-3 脂肪酸是一類(lèi)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，由于人體中缺乏 Δ?12 和 Δ?15 脫飽和酶，Ω-3 脂肪酸必須通過(guò)飲食獲取，并且被認(rèn)為對(duì)人類(lèi)健康至關(guān)重要。EPA 和 DHA 的攝入量的增加已被科學(xué)證明在治療和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、炎癥、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、嬰兒大腦發(fā)育和癌癥方面有益。許多流行病學(xué)、觀察性和臨床研究強(qiáng)調(diào)了 ω-3 脂肪酸在降低血漿甘油三酯水平和預(yù)防心血管疾病方面的有效性。全球的心臟病學(xué)會(huì)建議每天服用 ω-3 脂肪酸（EPA+DHA 或僅 EPA）的劑量為 4 克（總EPA + DHA 超過(guò) 3 克），這代表了一種有效的降甘油三酯治療劑。隨著這一關(guān)注度的增加，對(duì)高純度 ω-3 脂肪酸的需求激增。然而長(zhǎng)期的過(guò)度捕魚(yú)導(dǎo)致主要魚(yú)類(lèi)來(lái)源急劇下降，導(dǎo)致 ω-3 脂肪酸的價(jià)格迅速上漲。盡管如此，世界只有少數(shù)公司有能力生產(chǎn)藥用級(jí) ω-3 脂肪酸。因此開(kāi)發(fā)一種普遍適用且成本效益高的技術(shù)，以確保高純度 ω-3 脂肪酸的安全生產(chǎn)是必要的。在本研究中，使用 RP-MPLC 技術(shù)來(lái)制備高純度的 ω-3 脂肪酸乙酯，目標(biāo)總含量不低于 84% 的 EPA 和 DHA，這是根據(jù)藥典規(guī)定的。基本變量控制分離過(guò)程被評(píng)估和優(yōu)化，基于純度和回收率，包括填料材料、流動(dòng)相、樣品體積、樣品濃度、流速和流動(dòng)相組成。

色譜柱填料對(duì)分離效果的影響

色譜柱填料是色譜系統(tǒng)的“核心”，其物理化學(xué)性質(zhì)，包括包裝結(jié)構(gòu)的均勻性（單相、多孔或非多孔）、幾何形狀（粒徑、床面積和孔徑及形狀）以及所附接的配體類(lèi)型，對(duì)分離效能有顯著影響。為了尋找高通量、低背壓、高靈敏度和高分辨率以實(shí)現(xiàn)高效分離的色譜柱填料，對(duì)多種鍵合相材料（CN、Diol、C4、C6、C8、C18 和 AQ-C18）在 ω-3 脂肪酸乙酯的純化中進(jìn)行了評(píng)估（見(jiàn) 圖1 和 表1）

表1. AQ-C18 和 C18 對(duì) RP-MPLC 純化的 EPA 和 DHA 酯的影響。

注意：tR2 表示 EPA 的保留時(shí)間；tR3 表示 DHA 的保留時(shí)間；RS1 表示 EPA 與其前雜質(zhì)（組分A）的分離度；RS2 表示 DHA 與其后雜質(zhì)（組分D）的分離度。同一組中的不同字母表示顯著差異 (p<0.05) 。以下表格同樣適用此注釋。

C18 和 AQ-C18 填充材料的洗脫曲線顯示出 EPA 和 DHA 的明顯目標(biāo)峰，并且與相鄰的雜質(zhì)峰有良好的分離。AQ-C18 顯示了較早的峰出現(xiàn)時(shí)間，較短的純化時(shí)間和較低的溶劑消耗，與 C18 相比，這展示了更出眾的分離效率。C18 和 AQ-C18 都是非極性反相色譜固定相，帶有十八烷基碳鏈的硅膠。然而，AQ-C18 經(jīng)歷硅羥基的極性末端封口，減少了表面的殘留硅醇，從而增強(qiáng)了 ω-3 脂肪酸乙酯的分離效果（見(jiàn) 圖2）。因此，AQ-C18 被選為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的固定相。

流動(dòng)相對(duì)分離效果的影響

選擇合適的流動(dòng)相對(duì)于提高分離效率起著重要的輔助作用。低粘度、低沸點(diǎn)和低成本的溶劑被優(yōu)先考慮。在 圖3 和 表2 中，乙醇和乙腈在從 ω-3 脂肪酸中分離出雜質(zhì)時(shí)效果不佳，而甲醇則成功了。盡管甲醇的粘度較高，但其較低的沸點(diǎn)使得從產(chǎn)品中除去甲醇，比乙腈和乙醇更容易。因此甲醇被選為shou選的流動(dòng)相。

表2. 不同流動(dòng)相對(duì) RP-MPLC 純化 EPA 和 DHA 乙酯的影響。

流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例會(huì)改變其極性，從而影響樣品組分在固定相中的分配系數(shù)，并影響分離效率。增加甲醇比例會(huì)推遲峰出現(xiàn)時(shí)間，使峰形變寬，并減少脂肪酸乙酯 EPA 和 DHA 的保留時(shí)間、分辨率以及純度（見(jiàn) 圖4 和 表3）。這是因?yàn)樵黾恿鲃?dòng)相的極性已被發(fā)現(xiàn)能夠通過(guò)延遲非極性FAEE在柱中的保留時(shí)間來(lái)提高分離效率。當(dāng)甲醇比例為 86% 至 90% 時(shí)，ω-3 脂肪酸的純度逐漸下降；同時(shí)回收率提高。當(dāng)甲醇比例達(dá)到92%時(shí)，EPA 和 DHA 的脂肪酸乙酯純度降至 83.39%，這不符合國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)。甲醇比例超過(guò) 90% 不利于制備高純度的 ω-3 脂肪酸。因此選擇 90% 的甲醇溶液作為流動(dòng)相。

表3. 不同甲醇濃度對(duì) RP-MPLC 純化 EPA 和 DHA 乙酯的影響

上樣體積對(duì)分離效果的影響

根據(jù)色譜制備的非線性理論，增加樣品體積可以提高色譜的處理能力，提高產(chǎn)品回收率，并提高生產(chǎn)效率。如 圖5 所示，隨著負(fù)載體積的增長(zhǎng)，保留時(shí)間延遲，峰形變寬，分辨率降低，純化時(shí)間增加。這可能是因?yàn)楦嗟碾s質(zhì)在 AQ-C18 填料上吸附，影響了主峰和雜質(zhì)峰的分離，從而降低了目標(biāo)物質(zhì)的純度。當(dāng)樣品體積為 0.6mL 時(shí)，EPA 和 DHA 峰的總乙酯回收率最高(83.57%)。為了在實(shí)現(xiàn)更好的分離效果的同時(shí)大化負(fù)載體積，選擇了 0.6mL 的樣品負(fù)載量，相當(dāng)于色譜柱 1.25% 的柱體積。

表4. 不同上樣體積對(duì) RP-MPLC 純化 EPA 和 DHA 乙酯的影響

樣品濃度對(duì)分離效果的影響

在工業(yè)生產(chǎn)中，增加樣品的濃度可以增強(qiáng)色譜處理能力，而降低濃度有助于促進(jìn)分析物向色譜填料材料的分配和吸附過(guò)程，從而提高目標(biāo)物質(zhì)與雜質(zhì)的分離度。然而這種改進(jìn)是以相應(yīng)的回收率降低為代價(jià)。圖6 展示了不同濃度的魚(yú)油乙酯與甲醇混合的 RP-MPLC 色譜曲線，并附 表5。隨著魚(yú)油乙酯濃度的增加，EPA 和 DHA 乙酯的純度下降，而回收率、保留時(shí)間和分辨率表現(xiàn)出增加。相反，使用純魚(yú)油注射降低了 EPA 和 DHA 乙酯的分離因子，實(shí)現(xiàn)了 1.23 的前雜質(zhì)分離因子和 1.10 的后雜質(zhì)分離因子，純度為 85.75%。EPA 和 DHA 乙酯的回收率隨著樣品的濃度穩(wěn)步增加，達(dá)到純魚(yú)油時(shí)的峰值 74.62%。為了大化生產(chǎn)效率，選擇了純魚(yú)油乙酯。

表5. 不同濃度對(duì) RP-MPLC 純化 EPA 和 DHA 乙酯的影響

流速對(duì)分離效果的影響

在液相色譜系統(tǒng)中，增加流速可以縮短分析物的洗脫時(shí)間，但可能會(huì)降低色譜分析的穩(wěn)定性。隨著流速的增加，分析物的洗脫時(shí)間提前，峰形變得更加緊湊，導(dǎo)致乙酯 EPA 和 DHA 的峰與周?chē)s質(zhì)峰的距離更近（圖7）。隨著流速的加快，EPA 和 DHA 乙酯的洗脫時(shí)間持續(xù)縮短，導(dǎo)致保留時(shí)間和分辨率降低，從而純度下降（表6）。此外，EPA 和 DHA 乙酯的回收率也隨著流速的增加而持續(xù)下降，這可能是因?yàn)檫^(guò)高的流速可能會(huì)阻礙目標(biāo)化合物的吸附到固定相。為了優(yōu)化分離效率同時(shí)減少時(shí)間和溶劑的使用，選擇了 30mL/min 的流速。

表6. 不同流速對(duì) RP-MPLC 純化 EPA 和 DHA 乙酯的影響

ω-3 脂肪酸乙酯純化后的脂肪酸分析

含有相當(dāng)于色譜柱體積 1.25% 的魚(yú)油乙酯被引入裝有AQ-C18 填料的 RP-MPLC 柱（粒徑 20-40 微米，孔徑100?，表面積 320?340m²/g），并用 90:10（體積比）的甲醇-水溶液作為等度流洗脫劑，流速為30mL/min，操作壓力為 1-4bar，步琦 Pure Flash C-815 中壓制備色譜。在最佳純化條件下，魚(yú)油乙酯的 RP-MPLC 色譜圖如圖8所示。收集了 B 和 C 兩個(gè)餾分，并在減壓下濃縮，隨后通過(guò) GC-MS 進(jìn)行鑒定。總共鑒定出16種脂肪酸，以 2.39% 的單不飽和脂肪酸（SFA）、3.14% 的多不飽和脂肪酸（MUFA）和94.47% 的飽和脂肪酸（PUFA）的形式存在（圖9和表7）。與初始樣品相比，去除了 SFA C14:0、C15:0 和 C19:0；MUFA C24:1n9；以及PUFA C22:5n3、C20:3n6和C22:5n6。ω-3 PUFA 的比例從 78.59%上升到 90.34%，主要成分是 EPA 和 DHA，分別占 57.13% 和 28.14%，總計(jì) 85.27%。因此，通過(guò) AQ-C18 RP-MPLC 純化的 ω-3 脂肪酸乙酯符合《2020 年藥典》中“乙基多烯酸”的標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定 EPA 和 DHA 的含量至少為 84%。

表7. 純化 ω-3 脂肪酸乙酯的脂肪酸組成

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

通過(guò)使用 AQ-C18 色譜柱和步琦 Pure Flash C-815 中壓制備色譜，獲得了總 EPA 和 DHA 含量為 85.27%，回收率高達(dá) 74.30% 的 ω-3 脂肪酸乙酯。魚(yú)油樣品注射量為柱體積的 1.25%；以(90:10,v:v)的甲醇-水溶液作為流動(dòng)相，以 30mL/min 的流速進(jìn)行等速洗脫，操作壓力為 1-4bar。與 RP-HPLC 相比，雖然兩種方法生產(chǎn)的 EPA 和 DHA 乙酯純度均符合國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)，RP-MPLC 允許更大樣品的裝載量、更高的流速和更低的系統(tǒng)壓力，從而縮短了純化時(shí)間、提高了生產(chǎn)效率并降低了生產(chǎn)成本。

參考文獻(xiàn)

1. Sang, M.; Pan, N.; Wu, J.; Chen, X.; Cai, S.; Fang, H.; Xiao, M.; Jiang, X.; Liu, Z. Reversed-Phase Medium-Pressure Liquid Chromatography Purification of Ω-3 Fatty Acid Ethyl Esters Using AQ-C18. Mar. Drugs 2024, 22, 285. doi.org/10.3390/md22060285