一、摘要：

1型糖尿病是一種會導致胰腺β細胞破壞的自身免疫性疾病，需要終身胰島素治療。胰島移植提供了一個很有前途的解決方案，但也面臨著諸如可用性有限和需要免疫抑制等挑戰。誘導多能干細胞（iPSCs）為功能性β細胞提供了一個潛在的替代來源，并具有大規模生產的能力。然而，目前的分化方案，主要是在混合或2D環境中進行的，缺乏可延展性和懸浮培養的理想條件。

我們研究了一系列可能影響分化過程的生物反應器放大過程參數。該研究采用了一種優化的HD-DoE協議，該協議設計具有可擴展性，并在0.5L（PBS-0.5 Mini）垂直輪式生物反應器中實現。

我們開發了一種三階段的懸浮生長過程，從貼壁培養過渡到懸浮培養，TB2培養基在規模化過程中支持iPSC的生長。階段性優化方法和延長分化時間用于增強iPSC衍生的胰島樣簇的標記物表達和成熟。連續的生物反應器運行被用于研究營養和生長的限制以及對分化的影響。將連續生物反應器與對照培養基變化生物反應器進行比較，顯示出代謝變化和更類似b細胞的分化譜。從試驗中收集的低溫保存的聚集物被恢復，恢復后顯示出活力和胰島素分泌能力得到維持，這表明它們具有存儲和未來移植治療的潛力。

本研究表明，階段時間的增加或限制培養基補充以減少乳酸積累可以增加在大規模懸浮環境中培養的胰島素合成細胞的分化能力。

二、實驗內容節選：營養消耗和代謝物的分析

       為了檢測細胞潛在的替代碳源和氮源，我們分析了對照組和連續生物反應器在整個培養過程中的氨基酸代謝（圖S5A-B）。使用快速培養基氨基酸維生素分析儀Rebel（908 Devices）來分析氨基酸濃度。必需氨基酸，如組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸在整個培養期間都保持不變。然而，一些氨基酸在兩種培養基中都全部耗盡，包括5天后的L-天冬氨酸和16天后的L-谷氨酸。氨基酸代謝對正常的胰腺β細胞功能至關重要，丙氨酸和谷氨酰胺以其調節β細胞功能和胰島素分泌的作用而聞名。在培養結束時，谷氨酰胺和丙氨酸的濃度高于新鮮培養基，表明它們不限制生長（圖S5A-B）。然而，它們增加的來源仍然未知，不像之前的觀察而將它們的增加歸因于GlutaMAX™添加劑。與起始培養基相比，丙氨酸和谷氨酰胺水平的升高在對照組生物反應器中沒有觀察到，后者在不同階段之間和整個延長的內分泌誘導階段都有頻繁的培養基變化。兩種生物反應器之間無其他顯著性差異。如前所述，限制培養基補充的生物反應器比對照培養基變化的生物反應器具有更好的分化能力。氨基酸濃度調節和血清缺乏與促進來自人類干細胞的胰腺β細胞的發育有關。

       此外，使用FLEX2（Nova Biomedical）對兩種培養結果進行評估，分析兩種反應器的整個培養期間Gln、Glu、NH4+、Na+、K+、Ca++、pH、PCO2和PO2（圖S6A-B）。在連續生物反應器中，培養基的滲透壓穩定增加，但保持在280-320mOsm/kg范圍內。這種增加可以歸因于由營養物質代謝和其他廢物產生的溶質的積累。相比之下，對照培養基的滲透壓變化的生物反應器隨著培養基在細胞分化過程的不同階段被補充而波動。谷氨酰胺和谷氨酸水平也進行了評估，兩者都顯示隨著時間的推移而消耗。這與使用Rebel分析儀進行的測量結果一致。兩種生物反應器在生物分化上具有可比性，除了在連續生物反應器中pH的持續下降和預期的耗氧速率方面的主要差異。在反應液中測量的氣體可能會受到收集和測量之間時間的影響，但是，對所有樣品的總體影響是相同的。總體數據顯示，在培養10天或PP誘導分化階段后，PO2水平開始穩步下降。盡管反應液與兩個生物反應器頂空內的氣體體積相同(500毫升），但與控制培養基補充變化生物反應器相比，進入反應液的氧氣通量可能不足以補充0.5L連續容器中增加的耗氧量。