蛋白濃度測定的方法有很多，但每種方法都有其特點和局限性，因而需要在了解各種方法的基礎上根據(jù)不同情況選用恰當?shù)姆椒ǎ詽M足不同的要求。例如凱氏定氮法結果精確，但操作復雜，用于大批量樣品的測試則不太合適；Lowry法精確度較高，但是比較費時，且每步的時間要求相對嚴格；Bradford法靈敏簡便，但易受去垢劑的影響；BCA法以其試劑穩(wěn)定，抗干擾能力強，結果穩(wěn)定，靈敏度高而受歡迎。在蛋白濃度測定中，常見以下面四種方法為：

1. Bradford法：

原理：在酸性環(huán)境中，蛋白質結合考馬斯亮藍G250染料，導致染料的吸收發(fā)生位移，從紅棕色形式（吸收峰 465nm）轉化為藍色形式（吸收峰 610nm）。這兩種形式在 595nm 處光吸收差異most大，因此 595nm 是測定考馬斯染料-蛋白復合物的藍色的best佳波長。結合到每個蛋白質分子上的考馬斯染料分子數(shù)大致與蛋白所帶正電荷的數(shù)量成正比，因此通過比色法可以測定溶液中蛋白質的含量。

優(yōu)點：

1. 靈敏度高，可以檢測到1μg/ml的蛋白質濃度。

2. 反應時間短，反應時間只需5-10分鐘。

3. 操作簡單，只需加入試劑，混合均勻即可。

4. 適用范圍廣，適用于大部分類型的蛋白質。

5. 不受溶液中還原劑的影響。

缺點：

1. 受干擾：某些離子和化合物會干擾測定結果，去垢劑（表面活性劑）會產(chǎn)生強烈干擾，使得與許多常用的緩沖液不兼容。

2. 靈敏度不穩(wěn)定：不同蛋白質的靈敏度不同，有些蛋白質可能無法被檢測到。肽或蛋白質的分子量必須大于 3,000 道爾頓才能被檢出。

3. 需要標準曲線：需要制備標準曲線來計算蛋白質濃度，增加了操作步驟。

近來市場上已出現(xiàn)能兼容去垢劑的Bradford法蛋白定量試劑盒，可以兼容各種常用的蛋白緩沖液，大大拓展了應用范圍。

2. BCA法：

原理：在堿性環(huán)境下，蛋白質將銅離子還原成亞銅離子，二喹啉甲酸（BCA）與亞銅離子形成紫色的絡合物，這種絡合物溶于水并在562nm處產(chǎn)生光吸收峰值，光吸收強度在一定范圍內與蛋白質含量呈近似線性關系，因此使用比色法可以對蛋白質進行檢測和定量。BCA法沒有反應終點，反應會隨著時間而持續(xù)進行；通過一段時間的孵育后，反應速度會變慢，從而可以對大量樣品進行檢測。
優(yōu)點：

1. 靈敏度高，可以檢測到低至0.5μg/mL的蛋白質。

2. 對蛋白質分子量沒有要求，小分子量肽也可檢測。

3. 結果穩(wěn)定可靠，重復性好。

4. 可用于高通量的蛋白質測定。

5. 與Bradford法相比，可耐受一定濃度的去垢劑。

缺點：

1. 受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響：EDTA小于10mM，DTT和巰基乙醇均低于1mM。

2. 對不同蛋白質的反應性不同，因此不同蛋白質靈敏度有差異。

3. 與Bradford法相比，操作相對較復雜，需要多個步驟。

3. Lowry法：

原理：在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。通過比色法測定溶液中蛋白質的含量。

適合于測定20mg/L-400mg/L含量的蛋白質溶液，可檢測的蛋白質量低達5mg，通常測定范圍是20~250mg。

優(yōu)點：靈敏度高，可檢測低至1μg/mL的蛋白質；對于大部分蛋白質都有較好的線性關系。

缺點：

1.操作相對較復雜，需要多個步驟；

2.干擾物比較多，不僅還原劑和去垢劑會產(chǎn)生干擾，酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。

4. UV吸收法：

原理：利用蛋白質中的芳香族氨基酸（如酪氨酸、色氨酸）在280nm處的吸收峰，測定溶液中蛋白質的含量。

優(yōu)點：操作簡單，無需添加試劑；可同時測定多個樣品。

缺點：靈敏度較低，只能檢測高濃度的蛋白質；對于某些蛋白質（如酶）會產(chǎn)生干擾，導致測定結果不準確。

5. 瓊脂糖凝膠電泳：

原理：通過比較待測樣品與已知濃度標準品的相對強度，估算待測樣品中蛋白質的含量。

優(yōu)點：

1. 瓊脂糖凝膠電泳測蛋白濃度簡單易行，不需要昂貴的儀器設備。

2. 可以同時測定多個樣品的蛋白質濃度。

3. 可以測定不同分子量的蛋白質濃度。

缺點：

1. 瓊脂糖凝膠電泳測蛋白濃度的準確性不如其他方法，誤差較大。

2. 測定時間較長，需要等待凝膠電泳完成。

3. 不能測定低濃度的蛋白質，因為測定靈敏度較低。