植物蛋白質(zhì)提取方法總匯

一、植物組織蛋白質(zhì)提取方法
1、根據(jù)樣品重量（1g樣品加入3.5ml提取液,可根據(jù)材料不同適當(dāng)加入）,準(zhǔn)備提取液放在冰上.
　　2、把樣品放在研缽中用液氮研磨,研磨后加入提取液中在冰上靜置（3～4小時(shí)）.
　　3、用離心機(jī)離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃.
　　4、提取上清夜,樣品制備完成.
蛋白質(zhì)提取液：300ml
　　1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml
　　2、甘油（Glycerol）75ml
　　3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g
這種方法針對SDS-PAGE,垂直板電泳！
 

二、植物組織蛋白質(zhì)提取方法
三氯醋酸-丙酮沉淀法
　　1、在液氮中研磨葉片.
　　2、加入樣品體積3倍的提取液在-20℃的條件下過夜,然后離心（4℃8000rpm以上1小時(shí)）棄上清.
　　3、加入等體積的冰浴丙酮（含0.07%的β-巰基乙醇）,搖勻后離心（4℃8000rpm以上1小時(shí)）,然后真空干燥沉淀,備用.
　　4、上樣前加入裂解液,室溫放置30分鐘,使蛋白充分溶于裂解液中,然后離心（15℃8000rpm以上1小時(shí)或更長時(shí)間以沒有沉淀為標(biāo)準(zhǔn)）,可臨時(shí)保存在4℃待用.
　　5、用Brandford法定量蛋白,然后可分裝放入-80℃?zhèn)溆?
藥品：
　　提取液：含10%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮
　　裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中（終體積為5ml）,使用前再加入1M的DTT65ul/ml.
這種方法針對雙向電泳,雜質(zhì)少,離子濃度小的特點(diǎn)！當(dāng)然單向電泳也同樣適用,只是電泳的條帶會減少！
 

三、組織：腸黏膜
目的：WESTERN BLOT檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)
應(yīng)用TRIPURE提取蛋白質(zhì)步驟：
　　含蛋白質(zhì)上清液中加入異丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）
　　倒轉(zhuǎn)混勻,置室溫10min
　　離心：12000g,10min,4度,棄上清
　　加入0.3M鹽酸胍/95%乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量）
　　振蕩,置室溫20min
　　離心：7500g,5 min,4度,棄上清
　　重復(fù)0.3M鹽酸胍/95%乙醇步2次
　　沉淀中加入100%乙醇 2ml
　　充分振蕩混勻,置室溫20min
　　離心：7500g,5min,4度,棄上清吹干沉淀
　　1%SDS溶解沉淀
　　離心：10000g,10min,4度
　　取上清-20度保存（或可直接用于WESTERN BLOT）
存在的問題：加入1%SDS后沉淀不溶解,還是很大的一塊,4度離心后又多了白色沉定,SDS結(jié)晶測濃度,含量才1mg/ml左右.
解決：提蛋白試劑盒,另外組織大小適中,要碎,立即加2X BUFFER,然后煮5～10分鐘,效果很好的.
 

四、植物材料：水稻苗,葉鞘,根
1、200毫克樣品置于冰上磨碎
　　2、加lysis buffer,離心,10000rpm,4度,5min取上清
　　3、重復(fù)離心5min
　　lysis buffer：urea np-40 ampholine 2-me pvp-40
 

五、蛋白質(zhì)樣品制備
秧苗蛋白質(zhì)樣品的提取按Davermal等（1986）的方法進(jìn)行.
100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40（聚乙烯吡咯烷酮）及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入1.5 ml10% 三氯yi酸（丙酮配制,含10mM即0.07%β-巰基乙醇）,混勻,-20℃沉淀1小時(shí),4℃,15000r/min離心15min,棄上清,沉淀復(fù)溶于 1.5ml冷丙酮（含10mMβ-巰基乙醇）,再于-20℃沉淀1小時(shí),同上離心棄上清,（有必要再用80%丙酮（含10mMβ-巰基乙醇所得沉淀低溫冷凍真空抽干.
按每mg干粉加入20μl（可調(diào)）UKS液[9.5 M尿素,5mM碳酸鉀,1.25%SDS,0.5%DTT（二硫蘇糖醇）,2% Ampholine （Amersham Pharmacia Biotech Inc,pH3.5～10）,6% Triton X-100],37℃溫育30min,期間攪動(dòng)幾次,28度（溫度低,高濃度的尿素會讓溶液結(jié)冰）16000r/min離心15min,離心力越大時(shí)間長一點(diǎn)越好！上清即可上樣電泳.或者-70度保存.
 

六、植物根中蛋白質(zhì)的抽取
（1） sample,液氮研磨
　　（2） 裝1.5ml centrifuge 用tube
　　（3） 加1M KH2PO4+K2HPO4 700 ul
　　（4） 12000rpm,4度,10～15minite
　　（5） 取上層液,蛋白質(zhì)就在里面.