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VectorBuilder矢量輔助線

VectorBuilder整合了數(shù)十年實驗室經(jīng)驗和發(fā)表的研究成果中的矢量學知識，為我們提供矢量指南。在這里，你可以了解更多關于基因傳遞各個方面的生物學、歷史、機制和應用。我們在這里是為了確保您擁有優(yōu)化實驗設計所需的一切。

規(guī)則質粒基因表達載體

概述

 通過常規(guī)轉染將質粒載體遞送到哺乳動物細胞中是生物醫(yī)學研究中應用廣泛的程序之一。盡管多年來已經(jīng)開發(fā)了許多更復雜的基因遞送載體系統(tǒng)，如慢病毒載體、腺病毒載體、AAV載體和piggyBac，但傳統(tǒng)的質粒轉染仍然是許多實驗室基因遞送的主力。這在很大程度上是由于其技術簡單以及在廣泛的電池類型中具有良好的效率。用常規(guī)質粒載體轉染的一個關鍵特征是它是短暫的，只有極低比例的細胞將質粒穩(wěn)定整合在基因組中（通常小于1%）。

關于這個矢量系統(tǒng)的更多信息，請參閱下面的論文。

參考文獻主題

摩爾生物技術。16:151（2000）哺乳動物基因表達載體設計綜述

EMBO J.12:2539（1993）轉錄阻斷劑防止轉錄干擾

集錦

我們的載體經(jīng)過優(yōu)化，可在大腸桿菌中進行高拷貝數(shù)復制和高效轉染。用載體轉染的細胞可以基于用戶選擇的標記基因表達來選擇和/或可視化。

優(yōu)勢

技術簡單性：通過傳統(tǒng)轉染將質粒載體輸送到細胞中在技術上是簡單的，并且比需要包裝活病毒的基于病毒的載體容易得多。

非常大的貨物空間：我們的載體可以容納約30kb的總DNA。質粒骨架僅占約3kb，留下足夠的空間來容納用戶感興趣的序列。

高水平表達：質粒的常規(guī)轉染通常會在細胞中產(chǎn)生非常高的拷貝數(shù)（每個細胞高達數(shù)千個拷貝）。這可以導致載體上攜帶的基因具有非常高的表達水平。

缺點

載體DNA的不整合：質粒載體的常規(guī)轉染也被稱為瞬時轉染，因為載體在沒有整合的細胞中主要停留為游離體DNA。然而，質粒DNA可以以非常低的頻率（根據(jù)細胞類型，每102至106個細胞中就有一個）久整合到宿主基因組中。如果將耐藥性或熒光標記物摻入質粒中，則可以在延長培養(yǎng)后通過藥物選擇或細胞分選獲得穩(wěn)定整合質粒的細胞。

有限的細胞類型范圍：質粒轉染的效率因細胞類型而異。非分裂細胞通常比分裂細胞更難轉染，原代細胞通常比永生化細胞系更難轉染。周知，一些重要的細胞類型，如神經(jīng)元和胰腺β細胞，很難轉染。此外，質粒轉染在很大程度上僅限于體外應用，很少在體內使用。

基因遞送的不均勻性：盡管成功轉染會導致每個細胞的轉染質粒載體的平均拷貝數(shù)非常高，但這可能是高度不均勻的。一些細胞可以攜帶許多拷貝，而另一些細胞攜帶的拷貝很少或根本沒有。這與基于病毒的載體的轉導不同，后者往往導致相對均勻的基因遞送到細胞中。

關鍵組件

啟動子：驅動你感興趣的基因的啟動子就放在這里。

Kozak：Kozak一致序列。它被放在感興趣的ORF的起始密碼子前面，因為它被認為有助于真核生物中的翻譯起始。

ORF：你感興趣的基因的開放閱讀框架放在這里。

SV40晚期pA:Smian病毒40晚期多腺苷酸化信號。它促進上游ORF的轉錄終止。

巨細胞病毒啟動子：人類巨細胞病毒立即早期啟動子。它驅動下游標記基因的普遍表達。

標記：藥物選擇基因（如霉素耐藥性）、視覺可檢測基因（如EGFP）或雙報告基因（如EGFP/Neo）。這允許用載體轉導的細胞被選擇和/或可視化。

BGH pA：牛生長激素多腺苷酸化。它促進上游ORF的轉錄終止。

pUC ori：復制的pUC起源。攜帶這種來源的質粒在大腸桿菌中以高拷貝數(shù)存在。

氨芐青素：氨芐青素抗性基因。它允許在大腸桿菌中通過選擇氨芐霉素來維持質粒。

代表性矢量設計

VB ID矢量名稱描述

VB010000-9486rey pRP[Exp]-CMV>EGFP/Puro一種編碼由CMV啟動子驅動的EGFP:嘌呤霉素抗性融合蛋白的常規(guī)質粒。

VB900120-0467nuf-pRP[Exp]-CAG>DD-Cre一種編碼不穩(wěn)定的Cre重組酶蛋白的常規(guī)質粒，該蛋白在甲芐啶（TMP）存在下，在CAG啟動子的控制下發(fā)揮作用。

精準遺傳學：瀏覽Cre-lox工具箱

Cre-Lox系統(tǒng)是基因工程中的一種工具，可以精確控制基因表達和基因修飾。該系統(tǒng)由兩個主要成分組成：Cre重組酶和loxP位點。在這篇文章中，我們將回顧這兩個主要組件，并深入研究它們是如何每天在實驗室中應用的。在對系統(tǒng)進行概述后，我們將深入了解系統(tǒng)本身的進展，以及如何使用系統(tǒng)來推進發(fā)現(xiàn)。

“導致重組”-“交叉位點（x）P1”

Cre重組酶是一種來源于P1噬菌體的酶，在Cre-lox系統(tǒng)中發(fā)揮核心作用。首字母縮寫Cre起初來源于術語“導致重組”；然而，今天它也被稱為“環(huán)化重組酶”的縮短。這種酶具有識別被稱為loxP位點的特定DNA序列并與之相互作用的特能力。

LoxP位點，簡稱“交叉位點（x）P1”，是由兩個13堿基對的反向和回文重復序列組成的特異性DNA序列，由一個8堿基對核心序列間隔區(qū)分隔。Cre是一種位點特異性重組酶，它識別13個堿基對的反向重復序列，核心區(qū)的序列賦予Cre-lox系統(tǒng)方向性。當兩個loxP位點面向相反方向放置時，Cre重組酶使兩個位點之間的DNA片段翻轉。相反，當兩個loxP位點在同一方向上位于DNA片段的兩側時，Cre重組酶切除位點之間的片段，導致遺傳信息的缺失。在基因組的不同位置面對相同方向的成對loxP位點允許易位（圖1）。

Cre-lox系統(tǒng)的特特性使其能夠應用于基因工程中的幾種技術。Cre-lox系統(tǒng)受歡迎的應用之一是用于生產(chǎn)轉基因小鼠。在小鼠中，Cre-lox系統(tǒng)被廣泛用作條件基因操作的工具。研究人員將loxP位點戰(zhàn)略性地放置在靶基因周圍，制造出一種“floxed”基因。然后，在特定啟動子的控制下，用表達Cre重組酶的轉基因小鼠培育這些小鼠，從而實現(xiàn)基因修飾的空間和時間控制（圖2）。當Cre在特定組織或某些發(fā)育階段被激活時，它在loxP位點催化重組，導致靶基因的精確改變。這使得有條件的基因敲除、激活或其他修飾成為可能，以可控和動態(tài)的方式深入了解基因功能。小鼠的Cre-lox系統(tǒng)已被證明在理解基因功能、建模疾病和開發(fā)高精度的潛在治療干預措施方面是非常寶貴的。

例如，腫瘤抑制基因p53的條件敲除模型使研究人員能夠探索其在維持基因組穩(wěn)定性和防止不受控制的細胞生長方面的作用。通過Cre-lox技術激活KRAS等致癌基因，可以研究它們對腫瘤發(fā)生和發(fā)展的特定貢獻。PTEN、BRCA1/BRCA2和E-鈣粘蛋白等基因的條件性敲除模型提供了對其在各種癌癥類型（包括乳腺癌、卵巢癌和結直腸癌）中的作用的深入了解。這些模型通過允許以組織特異性或時間控制的方式靶向操縱特定基因，為揭示癌癥發(fā)展的復雜分子機制和在臨床前測試新的治療干預措施提供了寶貴的工具。

除了在小鼠系中使用外，Cre-lox系統(tǒng)經(jīng)常在體外用于受控的遺傳操作。這種方法使研究人員能夠利用非病毒載體，如含有loxP位點的質粒或DNA構建體，輕松地引入培養(yǎng)的細胞或細胞系。這些loxP側翼序列可以被工程化以攜帶感興趣的基因、報告基因或其他功能元件。隨后，可以用表達Cre重組酶的單獨構建體轉染細胞。細胞內Cre的存在導致loxP位點之間的位點特異性重組，從而產(chǎn)生所需的遺傳修飾。

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