洗滌不充分

 ● 增加洗滌次數

 ● 增加洗液體積

 ● 延長洗滌時間

 ● 確認Tween^® 20 (*)濃度

 無法阻斷非特異性結合

 ● 重新調節封閉溫度和時間。室溫下1 h，4℃下過夜

 ● 添加Tween^® 20 (*)

 ● 使用添加Tween^® 20 (*)的封閉緩沖液（TBS-T、PBS-T）

 ● 使用高靈敏度發光試劑（Immunostar^® 系列）

 膜處理不當

 ● 對膜進行必要的前處理

 ● 使用干凈的鑷子和手套，注意不要損壞膜。

 ● 孵育時振蕩

 ● 使用低背景且可高靈敏度檢測靶蛋白的CLEARTRANS^® 系列產品

 因設備、器皿的污垢造成的污染

 ● 充分清洗轉膜裝置、電泳槽等設備，操作過程中佩戴手套

 強化學發光信號

 ● 縮短檢測的曝光時間

 ● 縮短檢測試劑的反應時間

 ● 降低檢測試劑的濃度

 電壓過高發熱

 ● 降低電壓進行電泳

 鹽濃度不同

 ● 鹽濃度越高，移動速度越快，需統一樣品的鹽濃度

 上樣量不同

 ● 統一各個孔的上樣量

 有空孔

 ● 在空孔中上樣相同鹽濃度、相同液量的樣品，或僅上樣樣品緩沖液

 樣品存放時間久，存儲方法不當，

導致蛋白降解

 凝膠和膜之間有氣泡

 ● 使用滾筒等去除氣泡

 轉膜設備的問題

 ● 使用半干式設備時，反復使用會導致轉膜板彎曲，建議返廠維修或更換

    新的設備

 轉膜方法的問題

 ● 半干式設備容易引起轉膜不均勻的問題，可嘗試更換為濕轉儀

 蛋白量過高

 ● 降低電泳的蛋白量

 抗體濃度高

 ● 降低一抗、二抗的濃度

 檢測信號高

 ● 縮短曝光時間

 ● 縮短檢測試劑的反應時間，反應后盡可能去除試劑

 ● 降低二抗濃度

 蛋白量高

 ● 減少蛋白量

 抗體濃度高

 ● 降低一抗、二抗的濃度

 抗體失活

 ● 檢查抗體存儲狀態，時間

 ● 重新進行抗體反應時，推薦使用10 min即可去除抗體的“WB膜再生液“

 抗體結合力不足

 ● 確認抗體的稀釋濃度是否合適

 ● 延長抗體反應時間

 ● 對于低蛋白表達量的樣品，可增加電泳量，提高抗體濃度

 ● 使用抗原抗體反應促進試劑

 ● 更換高效轉膜緩沖液

 疊氮-化鈉抑制酶反應

 ● 疊氮-化鈉會抑制HRP的活性，因此抗體中含疊氮-化鈉時，需要稀釋抗體

   以降低疊氮-化鈉濃度或使用不含疊氮-化鈉的抗體

 ● 使用HRP標記一抗且阻斷劑中含有疊氮-化鈉時，需在封閉后使用 TBS-T

   清洗再進行抗體反應

 曝光時間短

 ● 延長曝光時間

 封閉時間不當

 ● 封閉時間過長時，封閉劑會遮蓋抗原，降低抗體反應性，因此需要確認封

   閉時間是否合適

 轉膜效率低，無法轉膜

 ● 延長轉膜時間

 ● 靶蛋白的分子量較高時(例：100   kD以上)，添加0.1%的SDS(十二烷基硫

   酸鈉)

● 使用預染蛋白Marker作為陽性對照，確認轉膜效率

 ● 使用具有抗體結合位點的分子量Marker作為陽性對照

 檢測試劑的化學發光弱

 ● 確認檢測試劑是否變質

 ● 使用高靈敏度的發光試劑“ImmunoStar^®系列“

 鑷子被污染

 ● 鑷子上的污垢會附著在膜上形成背景。需使用經乙醇消毒后的干凈鑷子

   夾住膜的邊緣

 洗滌不充分

● 增加洗滌次數和洗液體積

 抗體反應不當

 ● 增加抗體反應溶液，并振蕩使其反應

 檢測設備被污染

● 檢測前，使用乙醇擦拭放置膜的樣品臺，去除污垢

 蛋白未轉膜

 ● 確認轉膜設備是否正確運行

 ● 確認膜和凝膠是否正確接觸

 低蛋白量

● 增加蛋白的上樣量

 染色試劑變質

 ● 檢查染色試劑的有效期

 ● 更換凝膠染色試劑（Negative Gel Stain MS Kit、Ponceau 3R、

   Ponceau-3R StainSolution、Amido Black 10B）