細胞炎性壞死 (焦亡) 常伴隨著線粒體的損傷，這一切的背后到底是道德的淪喪還是……咳咳咳，這究竟是巧合還是早有預謀？讓我們隨著小 M 來探索一下其中的奧秘吧~

細胞焦亡又稱細胞炎癥性壞死，一種程序性細胞死亡方式，由炎癥小體的活化及炎癥性半胱天冬酶的激活引起，是機體免疫系統對抗外源病原菌入侵的主要手段之一[1][2][3][4]。往期研究發現 GSDMD/E 介導的細胞焦亡早期伴隨線粒體損傷發生，但其潛在機制和功能尚不清楚[5]。

近期，Miao 等人發表在 Immunity 的研究報道了 GSDMD 介導線粒體損傷的分子機制！對細胞死亡和炎癥來說，線粒體損傷是一條"不歸路"：激活的 Gasdermins 結合到線粒體的心磷脂，形成線粒體孔道，這將破壞兩個線粒體膜，導致活性氧的產生，氧化磷酸化的喪失，細胞毒性介質的釋放，以及線粒體自噬[1]。

GSDMD 介導線粒體損傷的分子機制[1]。

科學不廢話！各位看官，來一來，瞅一瞅，走過路過不要錯過哈哈哈，讓我們一起瀏覽一下吧~~

? 線粒體受損：評估線粒體敏感性和膜電位
研究人員使用 LPS + Nigericin 聯合處理 THP-1 巨噬細胞，結合染料 MTDR、MTG 以及 TMRM 進行染色，評估線粒體膜的電位和完整性 (圖 1A-B)。與鄰近的 SYTOX 或 PI 陰性活細胞相比，SYTOX 或 PI 陽性的焦亡細胞的 MTDR 和 TMRM 熒光明顯減弱，而 MTG 染色持續存在，表明線粒體在焦亡過程中去極化。

圖 1. 細胞焦亡對線粒體損傷的影響^[1]。

(A) 用 MitoTracker 深紅 (MTDR)、MitoTracker 綠 (MTG) 和 PI 染色的 LPS + Nigericin 處理的 THP1 的共聚焦熒光活細胞圖像。白色箭頭表示焦亡細胞。(B) 黑色箭頭表示正常線粒體；黃色箭頭，線粒體嵴缺失或膜損傷；紅色箭頭，自噬體內受損的線粒體。

同時，在添加 Nigericin 引發焦亡前后，用透射電子顯微鏡觀察 LPS 原生的 THP-1 細胞，可以看到線粒體形態發生了變化 (圖 1C-D)：

• 添加前：線粒體呈典型的卵形，由雙膜囊泡和內部嵴狀結構組成，但在添加后，線粒體收縮并圓潤起來，平均長度減少約 2 倍 。

• 添加后 15 min 內，觀察到含有損傷線粒體的自噬體。1 h 后，約 60% 的線粒體具有旋轉或消失的嵴狀結構和/或破裂的內線粒體膜 (IMM) 和外線粒體膜 (OMM)，線粒體數量減少約 2 倍。

在引發焦亡后的早期階段，線粒體受到了嚴重損害。此外，活化的 GSDMD-NT 會轉位至線粒體并在其膜上成孔，導致線粒體膜通透。

?  細胞先發生焦亡？還是線粒體損傷 ？

研究人員評估了 LPS + Nigericin 處理過的 THP-1 細胞中的線粒體膜電位 (TMRM 強度)、細胞 ROS 產生 (DCFDA 強度) 和質膜通透性 (SYTOX Green攝取) (圖 2A)。DCFDA 增加而 TMRM 降低發生在細胞攝取 SYTOX Green 之前，證實了線粒體功能不全在細胞死亡之前發生。

流式細胞術對 MitoSOX (線粒體 ROS)、DiIC1(5) (線粒體膜電位) 和 SYTOX Green 攝取進行的檢驗也證實了這一點 (圖 2B)。在 SYTOX Green 攝取之前約 10 min 就能檢測到 MitoSOX 和 DiIC1(5) 的顯著變化。

圖 2. 線粒體損傷發生在質膜損傷前，并增強焦亡^[1]。

(A) 利用酶標儀對 LPS 或 LPS+Nigericin (Ng) 處理的 THP-1 中的 DCF 和 TRM 強度以及 SYTOX Green 攝取進行動力學分析。(B) LPS+Nigericin (Ng) 處理的 THP1 處理后用 MitoSOX、DiIC1(5) 或 SYTOX Green 染色的的流式細胞術直方圖（上）和多個樣品的定量（下）分析結果。P，陽性對照（抗霉素 A處理檢測 MitoSOX，CCCP 處理檢測 DiIC1(5)，Triton X-100 處理檢測 SYTOX Green）；UNT，未經治療。

同時，使用溴化乙錠 (EB) 處理 iBMDMs (永生化小鼠骨髓來源巨噬細胞) 以生成缺少線粒體的 ρ° 細胞。經檢測，發現 ρ° 細胞對于經典及非經典的焦亡途徑炎癥小體誘導的焦亡具有抗性，線粒體缺陷會顯著降低細胞焦亡誘導，表明線粒體在焦亡中發揮關鍵作用。此外，胞質 ROS 可放大經典和非經典炎癥小體介導的細胞焦亡。

? GSDMD-NT 在質膜破裂前轉移并損傷線粒體

為了確定在活細胞中 GSDMD-NT 是否結合并介導線粒體功能障礙，我們對表達多西環素 (DOX) 誘導的 I105N GSDMD-NT 的 iBMDMs 進行了成像，該 GSDMD-NT 在其 C 末端融合了藍色熒光蛋白 (GSDMD-NT-BFP)。I105N 突變使焦亡速度減慢，從而使得更好地檢測到死亡細胞。

I105N GSDMD-NT-BFP 的 iBMDMs:

iBMDMs, Immortalized bone marrow derived macrophages，永生化骨髓源性巨噬細胞。作者使用了來自表達 Cas9 的小鼠的永生化骨髓源性巨噬細胞 (iBMDM)，即 Cas9 KI iBMDM。

作者在 Cas9 KI iBMDM 中穩定表達了 Tet3G 反式激活子，以及在 Cas9 KI Tet3G 穩定細胞中產生多西環素 (Dox) 誘導型 GSDMD 變體，這使得編碼 NT-GSDMD 和全長 GSDMD (FL-GSDMD) 的轉基因能夠通過Dox 誘導表達。其中包含 C 端 BFP 標簽。利用了包含 I105N 突變的 NT-GSDMD 變體 (已被證明可以防止巨噬細胞焦亡)，因為這種突變體比其野生型 (WT) 對應物更容易在細胞內檢測到[7][8]。

研究表明早期的 GSDMD-NT定位到線粒體 (圖 3 A-E)。在 DOX 誘導后 4-8 h，可以檢測到 GSDMD-NT-BFP。通過活細胞共聚焦成像觀察了添加 DOX 后 6 小時開始的 GSDMD-NT 定位、質膜通透性 (PI 或 SYTOX 攝取) 和線粒體損傷 (MitoTracker、TMRM 和 MitoSOX) 的動態 (圖 3A，3B)。

圖 3. GSDMD-NT 在質膜前易位并損傷線粒體^[1]。

(A 和 B) 通過DOX 誘導穩定表達 GSDMD-NT(I105N)-BFP 的 iBMDM，利用MitoTracker Deep Red 和 PI（左）、TMRM 和 SYTOX Deep Red (SYTOX DR)（中）或 MitoSOX Red 和 PI（右） 進行活細胞成像用評估線粒體損傷和細胞死亡，在添加 DOX 后 6 小時開始成像。時間 0 表示檢測到細胞中的 PI 或 SYTOX（藍色虛線)。

通過定義每個細胞在檢測到染料攝取 (質膜損傷) 時的時間為 0 來同步焦亡變化：在 DOX 后，最終經 PI 或 SYTOX 攝取評估死亡的 GSDMD-NT-BFP 表達細胞中，MitoTracker 和 TMRM 強度都降低了(圖 3A 和 3B)，而在表達 FL-GSDMD-BFP 的細胞中，線粒體染料強度和 PI 攝取保持不變 (圖 S2C-2F)。GSDMD-NT-BFP 至少在質膜通透性增加前 50 分鐘就與線粒體染料定位在一起 (圖3A 和 3B)，確認了早期的 GSDMD-NT 定位到線粒體。當然，作者也通過進一步的成像實驗證實 GSDMD-NT 與線粒體的共定位 (此處不再詳細展開)。

插一句：換個思路想，這就好比談戀愛， A 和 B 分手了，B 立刻就和 C 在一起了，說明啥？B 和 C 肯定早就在一起了嘛！哈哈哈哈僅供理解，不可細究喔~

此外，MitoTracker 和 TMRM 強度逐漸下降，而 MitoSOX 信號在 PI 或 SYTOX 攝取之前增加。所有線粒體標記最終消失，暗示線粒體溶解。在焦亡晚期，質膜已經被滲透后，從受損線粒體釋放出 MitoSOX Red。也就是說，細胞焦亡早期，GSDMD-NT 會首先轉位至線粒體，且在細胞膜成孔之前，造成線粒體損傷。

? GSDMD-NT 直接使 OMM 和 IMM 通透

為了確定 GSDMD-NT 是否自身就能結合并損傷線粒體膜，作者從 HCT116 (A-C)或 iBMDMs (D-E) 中分離出線粒體，在存在或不存在 z-VAD-FMK (泛 Caspase 抑制劑) 或 Disulfiram (DSF, GSDMD 孔形成的有效抑制劑) 的情況下，用 GSDMD 和/或 Caspase-11 或 t-Bid 處理。GSDMD 和 Caspase-11 處理可產生活性的 GSDMD-NT，并通過免疫印跡檢測釋放的線粒體蛋白以評估線粒體通透性 (圖 4A 和 4B)。

圖 4. GSDMD-NT 可通透并損傷分離的線粒體^[1]。

(A、B 和 D) 處理后通過免疫印跡檢測上清液或線粒體的蛋白 (A 和 D) 以及多個實驗的光密度測定 (B)。(C 和 E) 通過 qPCR 檢測上清液中的 mtDNA。

研究表明，GSDMD-NT 直接使 OMM 和 IMM 通透，而不需要其他因素。

• 添加 Caspase-11 和 GSDMD 后 5 分鐘內，可溶性線粒體基質蛋白 ACO2 和線粒體膜間隙蛋白 (IMS 蛋白：Cytochrome C 和 HtrA2) 從線粒體中釋放出來，而與膜結合的 COX IV 則沒有。泛 Caspase 抑制劑 z-VAD-FMK 抑制了釋放。

• 在添加 t-Bid 后，觸發凋亡中的 MOMP (線粒體外膜通透化) 而不破壞 IMM (線粒體內膜)，釋放出了 Cytochrome C 和 HtrA2，但沒有釋放 ACO2 (圖 4A-B)。

• 當線粒體與 GSDMD 和 Caspase-11 一起孵育時，也釋放出 mtDNA，但是單獨添加它們或者添加 t-Bid 時則沒有 (圖 4C)。

• 同時，處理分離的線粒體的 GSDMD 和 Caspase-11 也顯著增加了 ROS，并通過 MitoSOX Red 和 DiIC1(5) 染色分別降低了膜電位 (圖中未顯示)。

此外，Disulfiram 抑制 GSDMD 孔洞形成，但不干擾 GSDMD 切割或 GSDMD-NT 與膜的結合。在添加 GSDMD 和 Caspase-11 之前預先用 DSF 孵育分離的線粒體 (圖 4D-E)。DSF 阻止了 Cytochrome C 和 mtDNA 的線粒體釋放，證實了 GSDMD-NT 孔洞使線粒體通透。

? OMM 心磷脂是 GSDMD 介導的線粒體損傷所必須的
心磷脂是由 CRLS1 合成并由 PLSCR3 外化到外線粒體膜 (OMM) 上 (圖 5 A)，為研究 GSDMD-NT 介導的線粒體損傷是否需要 OMM 心磷脂，作者對 iBMDMs 中對 CRLS1 和 PLSCR3 進行了基因敲除 (Cris1-/-和 Plscr3-/- iBMDMs)，并用 LPS 和 Nigericin 進行處理。

圖 5. OMM心磷脂是GSDMD介導的線粒體損傷所必需[1]。

(A) 心磷脂合成和易位示意圖。PG，磷脂酰甘油；CDP-DAG，二磷酸胞苷-二酰基甘油。(B) LPS或 LPS+Nigericin 處理的表達 mNG-GSDMD 的 WT、Plscr3^-/-或 Crlsr1^-/- iBMDM 的共聚焦活細胞成像，在添加 Nigericin 30 分鐘后進行 MitoTracker 深紅染色。白色箭頭表示 GSDMD 的線粒體募集。(C) 未處理或Nigerici n處理 30 分鐘后，LPS 預處理的 iBMDM 的全細胞裂解物 (WCL)、胞質 (細胞) 和線粒體 (mito)的免疫印跡。 (D) 通過 qPCR 檢測胞質 mtDNA。

研究發現， OMM 心磷脂介導了 GSDMD 依賴性的線粒體損傷。

• 在 LPS+Nigericin 處理的 Cris1-/- 和 Plscr3-/- iBMDMs 中，GSDMD-NT 沒有被招募到線粒體 (圖 5B)，而線粒體完整性和膜電位、線粒體數量和平均長度以及損害線粒體的百分比幾乎恢復到未處理的 WT iBMDMs 的狀態 (圖中未顯示)。

• 此外，線粒體 ROS (圖中未顯示) 和 Cytochrome C 和 mtDNA 的胞質釋放 (圖5C-D) 也被阻止。一致地，用 GSDMD 和 Caspase-11 處理的 Crls1-/- 和Plscr3-/- iBMDMs 的分離線粒體沒有釋放 Cytochrome C、HtrA2 或 mtDNA (圖中未顯示)。

同時，GSDMD 介導的線粒體損傷誘導 3’端- 5’端的核酸外切酶 PNPT1 釋放入胞質，引發廣泛的 mRNA 降解以加重細胞焦亡發生、放大下游炎性反應。也正是如此，提供了一個強大的正反饋機制來放大細胞死亡，被稱為“不歸路”。此外，該研究還揭示了線粒體損傷增強細胞焦亡誘導的機體抗腫瘤免疫應答。

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參考文獻：
[1] Rui Miao, et al. Gasdermin D permeabilization of mitochondrial inner and outer membranes accelerates and enhances pyroptosis. Immunity. 2023 Nov 14;56(11):2523-2541.e8.
[2] Dominic P Del Re, et al. Fundamental Mechanisms of Regulated Cell Death and Implications for Heart Disease. Physiol Rev. 2019 Oct 1;99(4):1765-1817.
[3] Tessa Bergsbaken, et al. Pyroptosis: host cell death and inflammation. Nat Rev Microbiol. 2009 Feb;7(2):99-109.
[4] Xing Liu, et al. Inflammasome-activated gasdermin D causes pyroptosis by forming membrane pores. Nature. 2016 Jul 7;535(7610):153-8.
[5] Wei X,et al. Role of pyroptosis in inflammation and cancer. Cell Mol Immunol. 2022 Sep;19(9):971-992.
[6] Jibo Han, et al. GSDMD (Gasdermin D) Mediates Pathological Cardiac Hypertrophy and Generates a Feed-Forward Amplification Cascade via Mitochondria-STING (Stimulator of Interferon Genes) Axis. Hypertension. 2022 Nov;79(11):2505-2518.
[7] Aglietti RA,et al. GsdmD p30 elicited by caspase-11 during pyroptosis forms pores in membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Jul 12;113(28):7858-63.
[8] Evavold CL, et al. Control of gasdermin D oligomerization and pyroptosis by the Ragulator-Rag-mTORC1 pathway. Cell. 2021 Aug 19;184(17):4495-4511.e19.