Tissue-on-a-Chip: Microphysiometry With Human 3D Models on Transwell Inserts

微生理測量已被證明是用于監測活細胞能量代謝以及細胞間相互作用的有利工具，該技術之前主要用于監測二維細胞層。最近，我們的研究小組發現，微生理測量也可以自動檢測皮膚3D培養物的胞外酸化速率和跨上皮電阻值(TEER)，該培養物是培養在3D打印的封閉的生物芯片之中來維持氣液界面(ALI)。在這項工作中，我們提出了一種優化的多通道芯片用于監測商品化的3D小腸組織模型的TEER。實驗持續1天，60分鐘為重復周期，每個周期包括三個階段：(1)維護氣液界面(ALI)；(2)加入測量培養基或者試驗物；(3)清洗。初始平衡8小時后，加入細胞毒性和屏障破壞的化學物質（0.2%十二烷基硫酸鈉），導致TEER隨時間變化逐步降低，而以前傳統的細胞毒性測量方法是無法監測到這種變化的。這項工作證實了使用自動氣液界面(ALI)的多通道實時監測三維腸模型的TEER的可行性。培養的人體組織結合智能移動檢測技術，為在體外診斷提供了一個非常有前景的研究工具，特別是在毒理學，細胞代謝研究，藥物吸收等研究領域。

Keywords: microphysiometry, transepithelial electrical resistance, label-free monitoring, intestinal model, automated air–liquid interface

INTRODUCTION

盡管在藥物開發的臨床前階段進行了完整的試驗，但未發現的毒性依然是臨床階段失敗的一個常見原因（Kola and Landis, 2004; Marx et al., 2016）。藥物毒性的研究之中，重要的一點就是要考慮小腸的吸收效應。臨床前體內評估通常依靠小鼠或大鼠模型來代表人類特征（Le Ferrec et al.， 2001）。然而，嚙齒動物模型不能可靠地預測藥物對于人體的各個方面的效應，所以就可能出現對藥物毒性或再吸收的錯誤評估。因此，近年來的研究重點已轉移到改善體外毒性研究。

在體外研究可重復性和分離影響變量的能力（Ferrick et al., 2008），有助于更好地理解毒性機制。但是2D細胞培養和細胞系（Leonard et al., 2010; Ayehunie et al., 2018）有限的生理相關性和細胞培養實驗中缺乏全自動分析的問題已經在之前的文獻中討論過（Gómez-Sj?berg et al., 2007; Meyvantsson et al., 2008; Li et al.,2013）。 3D細胞培養領域的最新進展解決了這些局限性，并提供了新的模型來增強對新藥安全性和有效性的信心（Fang and Eglen, 2017; Park et al., 2018）。采用“組織芯片”方法，通過體外培養的組織和器官模型，來改進對吸收、分布、代謝和排泄（ADME）的評估（Madden et al., 2018）。

從結腸（大腸）癌中提取的Caco-2單層細胞是一種廣泛應用于體外藥物吸收和毒性評估的細胞系，它可以代表三個吸收途徑：跨細胞（細胞內途徑）、細胞間（細胞外途徑）和載體轉運。但是，細胞系和小腸組織的相關性有限。文獻中（Shah et al., 2006）已經描述，它只能預測跨細胞（細胞內途徑）滲透。此外，貼壁培養的單層Caco-2培細胞缺乏細胞-細胞和細胞-細胞外基質的相互作用，不能模擬人小腸的多層復雜結構。為了克服這種生理相關性的不足，科學家開發了新的三維重建人體組織模型（Li et al., 2013; Ayehunie et al., 2018）。在空氣-液體界面（ALI）上培養三維小腸器官模型，彌補了體外培養的2D的形態學缺陷（Nossol et al.，2011）。

使用體外組織培養進行藥物效應分析的常用方法需要很多重復的組織樣本，還有繁瑣復雜的實驗步驟。方法和測量的復雜性導致需要大量的人工以及細胞或組織相關的硬件設備，而這些又有可能導致細胞損傷，增加結果的誤判（Blume et al.， 2010）。

相對手動測試，實時自動分析細胞存活率是一種更優化的測量吸收和毒性的方案。此外，有了實時監測的數據，就可進行短期和長期的分析。對于長期的監測，自動化設備取代人工更換培養基和添加試劑，以提高實驗的通量和重復性（Kempner and Felder, 2002）。總之，對細胞培養進行實時連續測量可以同時觀察到多個細胞代謝參數，并且支持ALI培養的自動化微流控系統。我們在該研究中提出了這樣的一個測試系統：組織芯片（tissue-on-a-chip）結合ALI培養細胞（圖1）。通過生物芯片以及3D打印封閉的培養腔體成功培養了3D重建人類小腸模型。

  在這項工作中，我們提出了一個三通道、全自動的組織芯片測量系統（IMOLA-IVD，德國cellasys），該系統可以測量跨上皮細胞電阻（TEER），進一步深入了解上皮細胞層的組織形態和屏障特性。值得注意的是，與之前描述的單通道芯片系統相比，該系統在三個通道中都有一個自動的ALI，使用的細胞培養基更少（Alexander et al., 2018）。因此，現可以一次在三個的芯片上進行平行實驗，例如：測試物，對照和空白。

MATERIALS AND METHODS

Human 3D Tissue Model

實驗采用重建的三維腸組織—EpiIntestinal-FT。這個基于人體細胞的3D組織整合了腸上皮細胞、Paneth細胞、M細胞、簇細胞和小腸干細胞以及人小腸成纖維細胞，它被培養在ALI模擬生理條件之中。EpiIntestinal-FT模型可以用來表征小腸功能的不同方面，包括屏障功能、代謝、炎癥和毒性反應（Ayehunie et al ., 2018）。

Microphysiometric System

德國cellasys公司的IMOLA-IVD是一個由自動化微流控系統擴展的微生理測量系統（Brischwein和Wiest, 2019）。該設備的詳細設置在之前的報告中有描述（Weiss et al.， 2013）。簡單地說，就是生物芯片上裝有兩個交叉電極結構的電阻傳感器、兩個電化學的pH傳感器、一個電流的測氧傳感器和一個溫度傳感器。來自傳感器的測量數據被數字化記錄并傳輸到計算機上的專有軟件—Data Acquisition and Link Application（DALiA）軟件。該軟件負責流體的數據的處理和流路的控制，使用一個定制化的開/關協議，以控制蠕動泵和微流控系統（雙向交界處的閥門）。使用這些工具可以并行監控6通道IMOLA-IVDs同時獲得實時數據進行對比分析，例如測試物和陰性/陽性對照通道。

為了更好地使用和維護IMOLA-IVD和ALI，Alexander et al（2018）開發了一種新的封閉的培養腔設計，用Ultimaker 3D打印機打印的聚交酯并粘在生物芯片上。有了這種封閉的培養腔，就可以產生兩條不同的微流道：一條在培養腔頂端，一條是培養腔側面。通過一根頂端金電極和一根側面金電極傳感器可以測量在Transwell半透膜小室上培養的三維組織的TEER。

測量TEER的頻率為10kHz，外加電壓為30mv。結合密封腔的生物芯片和用于根尖線的射流頭如圖1所示。結合封裝的生物芯片和流路通道，如圖1所示。完整的設置如圖2所示。IMOLA suppo系rt 統(ISS-3)包括為IMOLA系統、用于控制流路系統的閥門的開關，以及用于記錄氣泡探測器數據的電子設備等提供電源。

DALiA客戶端軟件應用程序用于控制測量和記錄的數據。泵、流路模塊和細胞培養液等IMOLA系統都被安裝在通用的細胞培養箱內，保證整個實驗都在37?C。三個通道中的每一個都有兩條流路，一條是頂端，一條是側面，如圖3所示。兩種流路都可用于將多種物質注射到細胞環境之中，如培養基和測試物。在這篇文章中，頂端流路可以引入兩種不同的物質：基礎培養基和測試物。在TEER測量過程中，在培養的組織的頂端加入LBM低緩沖培養基，從而在頂端和基底側面（液體界面）之間建立一個導電連接。另外，頂端覆蓋了一層薄薄的培養基（空氣界面）（200nm）。基底側面流路定期向培養的組織的基底外側注入新的營養物質。在本研究中，流路系統的連接如圖3所示。1號閥用于更換頂端培養基；2號閥負責插入的培養小室的頂端的填充或排空；3和4號閥門分別將頂端和基底側面的培養基注入到生物芯片或廢液瓶中，5和6號閥門交替切換到過濾的空氣。一個IMOLA-IVD使用6個閥門和單向模式控制的4個泵通道。這里展示的裝置使用三個IMOLA-IVD模塊平行地研究三個培養小室（三個生物芯片，每個都有一個頂端和一個基底側面）。

Assay Preparation for Verification

為驗證流路系統的設置和測量，可以用磷酸緩沖液（PBS）做預實驗。對于頂端和基底側面，使用滲透壓為300±10% mOsmol/kg的PBS溶液，通過頂端通道的試驗物質為1000±10% mOsmol/kg的PBS溶液。

Assay Preparation for the EpiIntestinalTM Model

開始前，先將組織進行預培養以穩定狀態。然后注入5 ml 基底側面培養基 SMI-100-FT-MM (MatTek In Vitro Life Science Laboratories)；頂端加入200 μl 的SMI-100-MM (MatTek In Vitro Life Science Laboratories) ；然后在 37?C和5% CO2培養箱至少培養24 小時。實驗前，對整個系統進行滅菌和培養液預灌流。所有管道和頂端通過2.5%的次氯酸（Sigma Aldrich, #71696, diluted with double-distilled H2O）消毒20分鐘進行滅菌處理，生物芯片密封腔是通過浸潤在70%乙醇20分鐘進行滅菌處理。隨后，基底側面和頂端注入培養基，對管道進行預灌流處理。將整個系統和培養基放置在37?C和5% CO2培養箱之中過夜。最后，將含有小腸組織的培養小室放置在經滅菌處理的生物芯片上。基底側面流路使用

SMI-100-FT-MM (MatTek In Vitro Life Science Laboratories)。頂端流路使用無緩沖DMEM (cellasys GmbH, Kronburg, Germany: SOP-G200-006; see supplement material) 和溶解在 DMEM之中的測試物。

最后使用濃度為0.2或2.0%的十二烷基硫酸鈉(SDS)作為破壞3D小腸組織屏障的物質。在預先設定的灌流周期內，確定了兩個流體通道的時間順序。TEER測量周期包括：35分鐘ALI，10分鐘TEER測量和15分鐘的清洗周期。第一個ALI周期用于流體系統的內部預灌流，將程序設定為每個循環為1小時，持續灌流24小時。第8小時，將頂端培養基更換為含0.2% SDS的培養基，循環一個周期，然后更換為不含SDS的培養基。

RESULTS

Verification of the Measurement Procedure and the Fluidic System

每個TEER測量周期由測量階段和沖洗階段，循環程序的一致性可以確保整個監測期間的變化肯定是由待測物引起的。每次TEER測量開始時，培養小室的頂端為空的，慢慢填充相應的培養基。一旦達到足夠體積，TEER電極被浸沒在相應的培養基之中，并開始夠測量電阻。使用PBS溶液進行系統驗證的方法如圖4。TEER的振幅的最終標準值是244Ω。隨后加入測試物，電導率與PBS相比有所增高，電阻的振幅的準值下降到132Ω。重新注入PBS后稀釋待測物，再吸出。如果沒有第二次注入PBS，測試物將一直保留在培養環境之中，持續影響細胞。如圖4所示，需要兩次清洗的循環才能除去測試物。結果表明，IMOLA-IVD裝置的灌流系統和傳感器的在整個測量過程之中工作正常。因此可得出結論，傳感器是精確穩定的，振幅變化對應于注入的PBS滲透壓的變化。

Control Experiments

為了驗證該設置，在一個IMOLA上設計了一個帶有正負對照的測試實驗。在不添加任何物質的情況下監測小腸組織的TEER值20小時（陰性對照），然后在2.0%SDS的影響下監測20-28小時（陽性對照）。TEER測量每小時進行一次。在每個測量周期中，TEER值可以用

PBS測量后期的平臺期的平均值來表示，如圖4所示。這些平臺期的平均值被整合成一個連續的TEER數據圖。圖5顯示了TEER值的大小和相位（左）以及實部和虛部（右）。

TEER值通常只顯示大小,但是，為了顯示所有的測量值，測量的阻抗在兩種常用坐標系中充分顯示，即在極坐標下（左）表示大小和相位，在笛卡爾坐標下（右）表示實部和虛部。其數學表達式如公式1所示：

Tissue-on-a-Chip Model

Figure 6 加入0.2% SDS 的腸組織模型。經過開始的5小時，TEER達到270Ω的平均值。第8小時加入測試物SDS，TEER迅速上升，隨后線性降低，在第18小時降到到225Ω。需要注意的是，SDS不會改變細胞培養基的滲透壓濃度。測定的0、0.2和2.0% SDS的培養基的滲透壓濃度 (OSMOMAT 030, Gonotec, Berlin, Germany) 基本一致(300±5% mOsmol/kg)。

CONCLUSION

在這里，我們提出了原理證明實驗使用三通道微生理測量系統測量重建腸上皮模型的TEER與ALI。參數的測量是非侵入性的、實時的，并且系統定期自動更新培養基。在TEER測量中，培養小室的頂部也注入培養基。PBS和2.0% SDS的驗證實驗也證實了該測量方法和系統。

8 h后加入測試物（0.2% SDS）后發現TEER呈下降趨勢。在未來的工作中，我們建議進行后續實驗，使用測試物和微傳感器來獲取pH值和溶解氧的數據(Wiest et al.，2016)。

總的來說，IMOLA-IVD系統已被證明是一種靈靈活、可定制的系統，用于分析各種細胞培養物模型，包括貼壁的2D細胞系，3D球狀體，以及用于重構人類表皮和腸的組織/類器官芯片。未來的工作將包括研究和優化灌流循環(例如，增加測試物質之前的穩定期的時間)和電極幾何形狀，以及光譜測量信息的收集（Gilbert et al., 2019; van der Helm et al., 2019），以建立一種可用于肺或其他粘液細胞模型的多功能的組織芯片的研究工具。

DATA AVAILABILITY STATEMENT

The datasets generated for this study are available on request to the corresponding author.

AUTHOR CONTRIBUTIONS

All authors listed have made a substantial, direct and intellectual contribution to the work, and approved it for publication